文章摘要

軟骨作為高含水量的承重組織，具有優良的彈性和高強度。然而，開發軟骨適應性生物材料來替代或再生受損的軟骨組織仍然是一個巨大的挑戰。作者將蛋白質模板化和機械訓練相結合，制備了具有與軟骨相似的機械性能和含水量的晶體介導的殼聚糖納米纖維水凝膠（O-CN凝膠）。O-CN凝膠的水含量為1.74 wt%，具有高的拉伸強度（1.154 MPa）和楊氏模量（1.241 MPa），以及優異的生物相容性，抗溶脹性和抗菌能力。O-CN凝膠植入大鼠尾椎纖維環缺損模型后，可封閉軟骨（纖維環）缺損，維持椎間盤高度，最終防止髓核突出。這種蛋白質模板和機械訓練的協同策略為設計高度機械的水凝膠開辟了新的可能性，特別是用于承重組織的替換和再生。。

背景介紹

人體承重組織如骨骼肌、關節軟骨等，常因運動、負重等活動承受強烈機械應力。高含水量的軟骨，例如，需承受特定范圍的彈性與壓縮模量運動。這些組織一旦受損，需借助強健力學性能的生物材料進行修復。水凝膠作為一種高含水量的三維網絡材料，在組織工程修復領域展現出廣闊的應用前景。然而，大多數生物相容性水凝膠因機械性能不足，難以勝任承重組織的修復工作。盡管已采取多種策略來改善其機械性能，如化學/物理鍵耗散晶體結構形成等，但這些方法仍無法同時實現優異的機械性能與高保水性。例如，雙網絡水凝膠雖能通過物理交聯提升機械性能，但在軟骨工程修復中的表現仍顯不足；聚乙烯醇（PVA）凝膠雖展現出肌腱水平的拉伸性能，但其生物相容性卻令人擔憂；纏結工程化的蛋白質水凝膠雖壓縮性能出色，但拉伸性能和水含量卻相對較低。殼聚糖作為一種天然堿性多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性和抗菌性，在組織工程中應用廣泛。然而，殼聚糖膜在濕態下的機械性能較差，盡管可通過鹽析效應等方法提高其力學性能，但低水含量仍限制了其在體內組織工程中的應用。未來，或可借助犧牲模板法開發3D網絡支架，為解決這一問題提供新思路。

結果與討論

圖1.晶體介導的取向殼聚糖納米原纖水凝膠（O-CN凝膠）的制備示意圖。

作者提出了一種新的協同策略，通過蛋白質模板化和機械訓練在殼聚糖水凝膠中實現組合的高機械性能和高含水量性能（圖1A）。該體系通過在堿性條件下犧牲蛋白質體，將雙網絡殼聚糖/蛋白質（明膠或絲素蛋白）水凝膠（DNCG凝膠）轉化為物理交聯的單網絡殼聚糖納米纖維水凝膠（CN凝膠），通過疏水作用和氫鍵作用形成晶體介導的無規CN水凝膠（R-CN凝膠）。在機械訓練后，這些R-CN凝膠沿著拉伸方向排列以形成晶體介導的定向CN水凝膠（O-CN凝膠），其具有與軟骨（纖維環）的結構相似性（圖1B）。這些O-CN凝膠表現出極高的拉伸強度、模量和斷裂韌性，達到軟骨水平的機械性能（圖1C）。此外，O-CN凝膠具有與軟骨的含水量相似的高含水量、優異的生物相容性、抗菌性和抗溶脹性。

圖2CN凝膠的成分及形貌表征。

殼聚糖和明膠被用作模型系統，通過犧牲明膠配位網絡和機械訓練來制備超高強度和富含水的O-CN凝膠（圖1A）。CG凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像具有大孔（圖2A）。ii）CG凝膠中的明膠網絡在用乙醇（EtOH）的部分脫水過程中變得更加緊密（圖2B）。此外，在乙醇處理條件下，CG凝膠中的殼聚糖鏈通過疏水相互作用形成網絡，從而形成雙網絡CG凝膠（DN CG凝膠）。在暴露于氫氧化鈉（NaOH）溶液時，產生具有光滑表面和隨機納米纖維的R-CN凝膠（圖2C）。所得R-CN凝膠是透明的，并且可以承受扭曲（圖2D）和打結（圖2 E）的變形。明膠的FTIR光譜顯示出三個特征峰：酰胺I帶、酰胺II帶（和酰胺III帶（圖2F）。殼聚糖粉末和殼聚糖-NaOH凝膠具有明顯的特征吸收峰，分別對應于殼聚糖的酰胺I帶和NH 2吸收峰（圖2F）。在CG凝膠的情況下，酰胺帶中的峰位置與明膠相似（圖2F），而R-CN凝膠的峰與殼聚糖粉末和殼聚糖-NaOH凝膠相當。所得R-CN凝膠未顯示明膠的相關特征峰，這證明CG凝膠中明膠降解（圖2F）。為了進一步證明明膠在NaOH溶液中的降解，使用異硫氰酸熒光素標記的明膠（FITC-明膠）來構建CG凝膠。如圖2G所示，NaOH浸泡溶液中FITC的熒光強度隨著FITC-明膠降解而增加，在120 min時達到最大熒光強度，這與初始重量的FITC-明膠的相同熒光強度一致（圖2 H）。綜上所述，上述結果表明DN CG凝膠中的明膠在NaOH溶液中被犧牲以形成單一網絡R-CN凝膠。最后，將R-CN凝膠沿著拉伸方向排列，以在機械訓練后形成取向的納米原纖殼聚糖凝膠（O-CN凝膠）（圖2 I）。圖2 J顯示了R-CN凝膠的平滑表面，而O-CN凝膠在訓練后表現出由互連取向的納米纖維組成的中孔網絡（圖2K）。此外，根據O-CN和R-CN凝膠的橫截面形態，與R-CN凝膠不同，O-CN凝膠顯示出圓形球體或圓形結構（圖2 J;和圖2K）。

圖3.DN CG和R-CN凝膠的機械性能表征。

當在EtOH中處理時間增加時，DN CG凝膠的拉伸強度也增加（圖3A）。這種力學性能的提高主要歸因于CG凝膠的明膠化，因為明膠在與EtOH的部分脫水過程中可以形成更強的內部氫鍵。如圖3B所示，隨著NaOH處理時間增加，R-CN凝膠的拉伸強度也增加，而R-CN凝膠的模量幾乎保持不變。當NaOH濃度增加時，R-CN凝膠的斷裂韌性和拉伸應變下降（圖3C）。這種力學性能的下降主要是由于R-CN凝膠在高濃度NaOH溶液中的物理交聯密度過大，影響了殼聚糖鏈的纏結和殼聚糖晶體的形成。所開發的R-CN凝膠具有顯著的承重能力，可承受1 kg重量（圖3D），而明膠或殼聚糖-NaOH凝膠太弱且易碎，無法承受此重量。對于以下實驗，從用1 m NaOH處理24小時的CG水凝膠獲得R-CN凝膠。R-CN凝膠不僅具有優異的拉伸性能，而且在80%壓縮應變下顯示出21.2 MPa的應力（圖3E）。在該壓縮條件下，R-CN凝膠保持完整形狀，而CG凝膠容易破裂（圖3F）。R-CN凝膠能夠在40%壓縮應變下承受10000次連續壓縮-松弛循環，載荷損失小于35%（圖3G）。在10000次連續壓縮-松弛循環后，R-CN凝膠的壓縮模量增加，R-CN凝膠的壓縮應力也對應提高（圖3 H）。這些結果表明，R-CN凝膠可以實現高的機械性能，通過氫鍵和疏水相互作用的殼聚糖納米纖維鏈與NaOH處理。通常，水凝膠具有高機械性能，但保水性低。然而，所獲得的R-CN凝膠保持75重量%的相對高的水含量（圖3 I）。

圖4 機械訓練后O-CN凝膠的力學性能表征。

拉伸測試在O-CN凝膠上以平行（平行）和垂直（垂直）取向與對齊的納米纖維進行（圖4A）。O-CN凝膠（OCN）的拉伸強度為，幾乎是O-CN凝膠（OCN）的拉伸強度的三倍（圖4 B）。O-CN的模量和斷裂韌性。O-CN凝膠（OCN）的模量和斷裂韌性也高于O-CN凝膠（OCN）（圖4C、D）。此外，與R-CN凝膠相比，O-CN凝膠的拉伸強度從11.8 MPa增加到15.4 MPa，模量從4.2 MPa增加到24.1 MPa，斷裂韌性從8.5 MJ m ? 3增加到13.4 MJ m?3，使其能夠承受2 kg的重量（圖4 E）。O-CN凝膠的機械性能的這些增強可以歸因于結晶區域的重排和相鄰的殼聚糖鏈之間的氫鍵的增加，從而導致在機械訓練后密集堆積的殼聚糖納米纖維和水合殼聚糖晶體。作者比較了不同水含量下殼聚糖基水凝膠和常用材料的拉伸強度（圖4F），作者觀察到制備的O-CN凝膠表現出更高的拉伸強度和彈性模量，幾乎匹配軟骨的機械性質（圖4G）。高含水量和抗溶脹性能使O-CN凝膠非常適合應用于軟骨工程修復。

圖5. CN凝膠上的晶體排列表征。

20 °和8.2°的相同峰對應于殼聚糖晶體的（020）反射和（200）/（220）反射（圖5A）。與R-CN凝膠相比，O-CN凝膠在20°處的峰變窄，表明機械訓練后O-CN凝膠的晶體尺寸增加。圖5 B顯示R-CN凝膠的熱分解溫度為194 °C，而O-CN凝膠的溫度為220 °C。這些結果表明，與R-CN凝膠相比，O-CN凝膠表現出更高的熱穩定性。R-CN凝膠顯示出各向同性的Debye-Scherrer環，其峰為（200/200），表明晶體的隨機排列（圖5C，i）。隨著機械訓練期間的循環力從10 N增加到50 N，O-CN凝膠的（200/200）反射變得更強，表明殼聚糖晶體的重排和O-CN凝膠的增強的各向異性（圖5C）。同時，O-CN凝膠的強度和取向因子（f）也增加（圖5D、E），進一步表明隨著力的增加，取向得到改善。總的來說，O-CN凝膠具有高的機械性能，這是由于CN凝膠的結晶區域在機械訓練后的重排。

圖6. 大鼠模型中O-CN凝膠的放射學評估。

為了探索O-CN凝膠在體內促進纖維環修復的效率，作者在大鼠中建立了尾椎缺損模型。治療后4周和8周，采用放射學和組織學評估評價椎間盤退變（圖6A）。與對照組相比，O-CN凝膠在DHI方面表現出顯著差異，而在治療4周時，在O-CN凝膠組和假手術組之間未觀察到顯著差異（圖6 B、C）。術后8周后，與對照組相比，O-CN凝膠組顯示出更大的椎間盤高度保留，表明O-CN凝膠治療有效緩解了IVD退變的進展（圖6D）。然后，進行T2加權共振成像（MRI），以評價核的含水量（圖6 E）。O-CN凝膠組的含水量與假手術組相似，但在治療4周后顯著高于對照組（圖6 F）。隨著時間的推移，O-CN凝膠組和對照組之間的含水量差異顯著增加，在術后8周時變得更加顯著（圖6 G）。Pfirrmann分類顯示，在4周和8周時，與對照組相比，O-CN凝膠組的瓣膜退行性變程度較低（圖6 H，I）。這些影像學結果表明，與對照組相比，O-CN凝膠在延遲瓣膜隨時間的退變方面具有顯著優勢。

圖7.大鼠模型中O-CN凝膠的組織學評價。

在8周椎間盤切除術后，對照組中存在嚴重破壞伴髓核突出（圖7A）。在給藥后4周和8周后，對照組嚴重萎縮，蛋白聚糖區顏色較淺，而O-CN凝膠組輕微退化，與假手術組相似（圖7 B）。為了進一步評價椎間盤的修復效率，使用免疫組織化學分析評估聚集蛋白聚糖（ACAN）和I型膠原（Col I）的表達水平（圖7 C、D）。假手術組和O-CN凝膠組在第4周和第8周時顯示出最低等級，表明瓣膜變性較少（圖7 E-G）。總之，這些組織學發現證明原位植入O-CN凝膠有效地愈合了環缺損并減輕了椎間盤的退變。

圖8. 高強度CN凝膠設計的通用方法。

作者推測其他蛋白質也可以作為犧牲體來制備高強度CN凝膠。為了驗證這種可預測的一般性，作者使用絲素蛋白來制造CN凝膠。FTIR圖像顯示了絲纖蛋白在NaOH溶液中的降解（圖8A）。采用Cy5.5-標記絲素蛋白追蹤降解過程（圖8B）。結果表明，標記的絲纖維在90分鐘內降解。SEM表征表明，所得R-CN（SF）凝膠顯示出粗糙的表面（圖8 C），而O-CN（SF）凝膠在機械訓練后顯示出粗糙的纖維表面（圖8D），呈現出與使用明膠犧牲制備的R-CN凝膠和O-CN凝膠相似的趨勢。O-CN（SF）凝膠的楊氏模量、斷裂韌性、拉伸強度和應變分別達到10.6 MPa、10.6 MJm-3、12.8 MPa和193%（圖8 E），其也可以承受1 kg的重量（圖8 F）。與O-CN凝膠相比，O-CN（SF）凝膠的力學性能較低，這可能是由于明膠和絲纖維之間氨基酸組成和空間結構的差異造成的然而，當與其他物理或化學交聯殼聚糖/絲纖蛋白凝膠相比時，O-CN（SF）凝膠具有優異的保水性和優異的機械性能，使它們更好地與軟骨的力學相匹配（圖8 G）。因此，犧牲網絡和機械訓練策略可以應用于不同的蛋白質，以制造高強度CN凝膠。

文章總結

綜上，作者成功地開發了一種新的方法，通過結合犧牲天然網絡體與機械訓練過程來制備超強和高含水量的O-CN凝膠。明膠在氫氧化鈉溶液中降解形成晶體介導的無規凝膠（R-CN凝膠）。經過機械訓練后，R-CN凝膠沿拉伸方向沿著排列，導致高拉伸強度（15.4 MPa）、模量（24.1 MPa）和斷裂韌性（13.4 MJ m?3）的O-CN凝膠的再生。此外，該方法還使O-CN凝膠具有較高的含水量（約74wt%）、良好的生物相容性、抗菌性和抗溶脹性。該方法的通用性通過其對明膠和絲素蛋白作為犧牲網絡的適用性來證明。卓越的機械性能、高含水量和抗溶脹特性使這些O-CN凝膠非常適合軟骨修復。最終，所得到的OCN凝膠可以防止核突出，保持高水化，并通過大鼠尾椎缺損保持椎間盤高度，顯示出負載軟骨工程的潛力。未來的努力可以針對定制的OCN凝膠的性能，以滿足在大型動物模型中的組織工程的特定要求。

文章信息

Zhou D, Wang W, Ma W, et al. Cartilage‐Adaptive Hydrogels via the Synergy Strategy of Protein Templating and Mechanical Training[J].

Adv. Mater.

來源：超分子光化學與自組裝