小鼠頭部固定裝置/小鼠腦室顯微觀察固定器是神經科學研究中針對活體腦功能動態觀測的核心設備，其創新性設計集精準定位、穩定固定與多模態兼容于一體。在雙光子顯微成像場景中，該裝置通過預手術在小鼠顱骨表面埋植鈦合金適配基座，實現了顱窗區域與顯微鏡物鏡的快速精確定位耦合。

自由活動小鼠光遺傳學抑制在雙側MEC注射AAV-eNpHR3.0-mCherry的小鼠上進行。將光纖植入到雙側MECII-DG環路上方，抑制光在光纖末端的能量為15mW。在水迷宮空間任務中，光遺傳學抑制從動物下水前開始，直到小鼠到達逃生平臺，或者開始任務后40s。

Morris水迷宮

采用Morris水迷宮作為小鼠空間導航與空間學習記憶的行為學任務模型。在一個直徑120cm，高40cm的圓形水池中裝入溫度為20°C±1°C的水。水深度為11cm，水中加入不透明的氧化鈦并混合均勻，使池中的水變為不透明狀態。在距離池壁30cm的位置放入一個直徑10cm，高度10cm的圓形逃生平臺，平臺淹沒在不透明的水下。在池壁上貼有醒目的標記，作為小鼠找到逃生平臺的空間參考。水迷宮正上方裝有紅外模式下工作的相機，能夠對整個水迷宮場景進行錄制。水迷宮周圍用灰黑色窗簾圍繞，減小外界對小鼠行為帶來的干擾。

在所有的訓練試驗中，平臺的位置都是固定的。每只小鼠每天進行4次訓練，連續訓練3天，每次訓練間隔為15分鐘。在每次訓練，小鼠從隨機的起始位置釋放，在70秒的時間窗內被允許進行逃生平臺的自由搜尋。如果小鼠在給定的時間窗內沒有找到逃生平臺，實驗者小心將小鼠引導到逃生平臺上。小鼠在逃生平臺上停留20秒后被小心取出水迷宮，放置在休息臺上用吸水紙小心吸掉多的水分，然后用電烤火爐加熱保持溫暖。小鼠被烤干后放入到飼養籠中休息，等待下一次訓練。

Morris水迷宮

（a）實驗示意圖（b）實驗真實場景圖

經過3天的訓練，當小鼠能夠連續在10秒內快速到達逃生平臺，則被視為訓練成功。訓練成功后設計了一個不同時長線索暴露的實驗，對訓練好的小鼠進行了全程線索、1s線索和無線索的測試。全程線索是在整個任務過程中給小鼠提供正常的環境照明；1s線索從小鼠入水開始只給小鼠提供1s時間的環境照明，1s時間后將所有的環境照明關掉；無線索從小鼠入水前就關閉所有的環境照明，使小鼠處于一個完全黑暗的環境。

接著對小鼠進行新環境測試，采用一個完全不同的水迷宮對訓練好的小鼠進行測試。新水迷宮為一個方形水迷宮，其顏色、形狀、材質以及所處的環境都與原來訓練用的水迷宮有明顯區別。

在這些測試都完成后將逃生平臺取出，通過統計小鼠在逃生平臺所在象限搜尋的時間比例來衡量小鼠對逃生平臺位置記憶的穩固程度，并記錄MECII-DG環路鈣信號的變化。小鼠從距離原逃生平臺位置最遠的地方開始任務，在水中搜尋80s后被取出。每只小鼠進行兩次去掉逃生平臺測試，記錄的視頻追蹤運動軌跡，并進行統計分析。

八臂迷宮

本文同樣采用了八臂迷宮行為學來測試小鼠的空間記憶。八臂迷宮由八根伸出來的8個放射狀的臂和位于中心的平臺構成。中心平臺直徑為40cm，每個臂的尺寸為50cm×10cm（長×寬），高度為8cm。在每個臂的末端都開有一個直徑約2cm的小孔，可用來盛放飲用水，而在迷宮的中心看不到小孔中是否放有水。在八臂迷宮周圍的墻面上放有明顯的視覺線索，用于指示目標臂的位置。

八臂迷宮

（a）實驗示意圖（b）實驗真實場景圖

訓練前三天開始給小鼠進行飲水控制，每天每只小鼠飲水量為1ml，并在下午5:00~6:00喂水。限水后第二天和第三天，小鼠被放到八臂迷宮中自由探索15min。第二天在每個臂的中央和末端放置一小滴水，使得小鼠能夠對整個環境進行探索適應；第三天則在每個臂末端的小孔中放置約0.1ml水，使小鼠適應在小孔中喝水。在正式訓練過程中，選擇一個臂作為目標臂，在同一個小鼠接下來的所有訓練中都集中在這個臂的小孔中放置飲用水作為獎勵，每次訓練放置的水量為0.1ml。小鼠從迷宮的中心開始任務，每天訓練5次，訓練時長為8天。小鼠的行為通過八臂迷宮正上方的紅外相機記錄下來，通過線下分析小鼠在找到目標臂末端的水之前進入錯誤臂的次數，以及所花時間來對小鼠空間記憶準確程度進行量化分析。

曠場測試

為檢測光遺傳學抑制MECII-DG環路對一般的運動行為的影響，在曠場實驗條件下對小鼠MECII-DG環路進行光遺傳學抑制，觀察小鼠運動在抑制期間是否存在異常。曠場實驗場景為50cm×50cm的正方形盒子，實驗對象為雙側MEC第2層注射AAV-CaMKII-eNpHR.0病毒的實驗組和注射AAV-syn-eGFP或者AAV-syn-mCherry病毒的對照組。兩組小鼠均在雙側MECII-DG環路上方埋置通光直徑為200μm的光纖。整個實驗過程持續20min，前兩分鐘的數據未納入分析。后面的18min被分為6個時間段，每段持續3min。第1、3、5時段為抑制關時段，第2、4、6時段為抑制開時段。而在抑制開的時段內，每60s時間內的30s，激光器連續打開，在抑制關的時段內，激光器一直處于關閉狀態。小鼠在曠場中的活動被紅外相機錄制，計算小鼠在不同時間段內的運動速度。

1）在小鼠水迷宮空間任務學習過程中記錄MECII-DG環路軸突末梢的鈣信號為了對小鼠空間學習過程中MECII-DG環路的活動進行研究，采用自主開發的用于軸突末梢記錄的光纖光度儀在小鼠進行空間導航任務學習過程中，對該環路的軸突末梢進行鈣信號記錄。

2）小鼠在水迷宮導航任務中MECII-DG環路形成PTA活動

在小鼠進行水迷宮任務時，采用光纖記錄的方式對MECII-DG環路的鈣信號進行了實時檢測。本文發現這個環路的鈣信號隨著學習的進行而發生變化，呈現出增強的趨勢。在小鼠剛進行水迷宮訓練時，MECII-DG環路中的整體活動水平較低，活動的模式為隨機出現的瞬時增強的鈣信號。而在訓練好的小鼠中，該環路的鈣信號不僅在幅度上大幅度增加，且呈現為持續活動，將其命名為任務關聯持續活動（PTA）。PTA活動從小鼠開始任務快速上升到較高水平，一直持續，直到小鼠找到逃生平臺后才降回到基線水平。

在水迷宮任務學習過程中，小鼠MECII-DG環路鈣信號發生變化

上圖為來自一個小鼠的記錄，左邊為第一次訓練，中間為第五次訓練，右邊為學會的狀態。圓圈中的線條為小鼠搜尋的軌跡圖，不同顏色與鈣信號顏色的時間段相對應。下圖為6個小鼠的平均，實線為均值，陰影為標準誤，中間和右邊的信號按照小鼠找到逃生平臺的時間對橫軸進行歸一化。

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