摘要:嵌合抗原受體（CAR）T 細(xì)胞療法在治療復(fù)發(fā)或難治性血液癌癥方面效果顯著，但目前主流的體外生產(chǎn) CAR-T 細(xì)胞方法存在過(guò)程復(fù)雜、成本高昂等問(wèn)題。近年來(lái)，體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程技術(shù)成為研究熱點(diǎn)，該技術(shù)通過(guò)直接向患者體內(nèi)輸注納米顆粒包裹的核酸或工程病毒載體，在體內(nèi)生成 CAR-T 細(xì)胞。本文將闡述體外 CAR-T 細(xì)胞制造流程，分析體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程的優(yōu)勢(shì)、面臨的挑戰(zhàn)及在多種疾病治療中的應(yīng)用前景。

一、CAR-T 療法：癌癥治療的重大突破

CAR-T 細(xì)胞療法是癌癥治療領(lǐng)域的一項(xiàng)突破性技術(shù)，主要用于治療復(fù)發(fā)或難治性 B 細(xì)胞惡性腫瘤。CAR 分子由靶向部分（通常是抗體衍生的單鏈可變片段 scFv）與細(xì)胞內(nèi)的 CD3ζ 和共刺激結(jié)構(gòu)域（如 CD28 或 CD137）融合而成，能夠讓 T 細(xì)胞重新定向，精準(zhǔn)識(shí)別并攻擊腫瘤細(xì)胞表面的抗原。

在過(guò)去十年，CAR-T 療法在治療白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等血液癌癥方面取得了巨大進(jìn)展，已有 6 種 CAR-T 產(chǎn)品獲得美國(guó) FDA 批準(zhǔn)。例如，靶向 CD19 的 CAR-T 細(xì)胞在治療復(fù)發(fā)或難治性 B 細(xì)胞淋巴瘤時(shí)，完全緩解率可達(dá) 40 - 54% ；在治療 B 細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病時(shí)，完全緩解率高達(dá) 71 - 81% 。同時(shí)，針對(duì)漿細(xì)胞上特有的 B 細(xì)胞成熟抗原（BCMA）的 CAR-T 細(xì)胞，在治療復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤方面也成效顯著 。

二、體外 CAR-T 細(xì)胞制造：復(fù)雜且昂貴的現(xiàn)狀

目前，所有獲批的 CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品以及大多數(shù)正在臨床測(cè)試的細(xì)胞療法，都采用體外生產(chǎn)的方式，使用患者自身的 T 細(xì)胞。整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程十分復(fù)雜（如圖 1A），需要專業(yè)技術(shù)人員、嚴(yán)格的質(zhì)量管理體系以及專門的設(shè)施設(shè)備。

首先，要通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)采集患者的 T 細(xì)胞，運(yùn)輸?shù)缴a(chǎn)設(shè)施后，用 CD3 和 CD28 共刺激分子及細(xì)胞因子激活細(xì)胞，再利用 γ - 逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體將 CAR 轉(zhuǎn)基因?qū)?T 細(xì)胞，經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，為患者定制包含數(shù)億個(gè)修飾 T 細(xì)胞的產(chǎn)品。

這個(gè)過(guò)程不僅耗時(shí)，從采集 T 細(xì)胞到回輸（靜脈到靜脈時(shí)間）通常需要幾周，病情進(jìn)展快的患者還需進(jìn)行橋接治療；而且成本極高，每位患者的費(fèi)用超過(guò) 50 萬(wàn)美元，加上其他相關(guān)程序，總費(fèi)用可能超過(guò) 100 - 150 萬(wàn)美元 。此外，患者個(gè)體差異、病毒隨機(jī)整合和表達(dá)不一致等問(wèn)題，還會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量和整體療效的差異 。

表 1：用于遞送 CAR 遺傳信息的平臺(tái)概述

三、體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程：簡(jiǎn)化治療的新希望

為解決體外 CAR-T 細(xì)胞療法的局限性，體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。該技術(shù)借助病毒載體工程和非病毒核酸遞送平臺(tái)（如脂質(zhì)納米顆粒 LNP 或聚合物納米顆粒），將 CAR 遺傳信息直接遞送至患者體內(nèi)，在體內(nèi)生成 CAR-T 細(xì)胞，制成 “現(xiàn)成” 產(chǎn)品（如圖 1B） 。這種方法具有多方面優(yōu)勢(shì)：

物流優(yōu)勢(shì)：生產(chǎn)具有特定理化性質(zhì)的單一載體或納米顆粒藥物產(chǎn)品，可簡(jiǎn)化制造和釋放測(cè)試流程，縮短供應(yīng)鏈，降低成本，讓病情危急的患者更快接受治療，推動(dòng)療法的廣泛應(yīng)用。

生物學(xué)和安全優(yōu)勢(shì)：體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞療法依賴患者體內(nèi)已有的 T 細(xì)胞，無(wú)需進(jìn)行淋巴耗竭化療，減少了相關(guān)并發(fā)癥；完整的免疫系統(tǒng)有助于產(chǎn)生更廣泛的抗腫瘤免疫反應(yīng)，防止腫瘤細(xì)胞因抗原逃逸而導(dǎo)致治療失敗 。此外，該療法還能簡(jiǎn)化多抗原靶向治療，基于 mRNA 的體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞短期表達(dá)特性，便于實(shí)時(shí)調(diào)整劑量，減少細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和免疫效應(yīng)細(xì)胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS）等毒性反應(yīng)，同時(shí)避免 T 細(xì)胞耗竭 。

四、體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程的實(shí)現(xiàn)途徑

（一）納米顆粒遞送系統(tǒng)

LNP 和基于聚合物的納米顆粒都能將 CAR 編碼的核酸遞送至 T 細(xì)胞。LNP 由四種脂質(zhì)成分混合而成，可通過(guò)表面修飾靶向抗體（如抗 CD4 或 CD5），增強(qiáng)與 T 細(xì)胞的結(jié)合和內(nèi)吞作用；PBAE 聚合物納米顆粒則通過(guò)與帶負(fù)電的核酸靜電相互作用自組裝，并利用聚谷氨酸偶聯(lián)抗體（如抗 CD8 或 CD3）實(shí)現(xiàn) T 細(xì)胞靶向 。

將體外轉(zhuǎn)錄的 mRNA 封裝在納米載體中，可實(shí)現(xiàn) T 細(xì)胞功能的瞬時(shí)重定向。mRNA 具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)密碼子優(yōu)化和修飾核苷，能減少免疫反應(yīng)，提高翻譯效率 。此外，還可通過(guò)優(yōu)化 LNP 脂質(zhì)組成、調(diào)整制劑參數(shù)或使用其他 RNA 種類（如自我擴(kuò)增 RNA 或環(huán)狀 RNA），延長(zhǎng) CAR 表達(dá)時(shí)間 （如圖 2 左）。

（二）病毒載體遞送系統(tǒng)

慢病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）是體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞療法研究常用的病毒載體，其中慢病毒應(yīng)用最為廣泛。為提高 T 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，需對(duì)慢病毒進(jìn)行假型改造，使用修飾后的包膜蛋白（如麻疹病毒、尼帕病毒等的包膜蛋白），并表達(dá)靶向配體（如 scFv、納米抗體或 DARPin） 。AAV 則可通過(guò)修飾衣殼展示 scFv 或 DARPin 實(shí)現(xiàn)靶向 。

病毒載體的優(yōu)勢(shì)在于臨床級(jí)制造方案成熟，慢病毒可使 CAR 轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合表達(dá)，AAV 雖不整合，但附加體表達(dá)可持續(xù)數(shù)周、數(shù)月甚至數(shù)年 。然而，慢病毒基因轉(zhuǎn)移的永久性要求嚴(yán)格控制轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞類型，避免轉(zhuǎn)基因整合到生殖細(xì)胞或體細(xì)胞中導(dǎo)致潛在風(fēng)險(xiǎn) （如圖 2 右）。

圖1：體外和體內(nèi)細(xì)胞治療制造策略概述

圖2：體內(nèi)細(xì)胞治療平臺(tái)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞重定向機(jī)制

五、體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

（一）應(yīng)用前景

體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程技術(shù)不僅適用于癌癥治療，還可拓展到傳染病、自身免疫性疾病和纖維化等領(lǐng)域。在自身免疫性疾病方面，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，可利用 CAR-T 細(xì)胞清除致病的自身反應(yīng)性 B 細(xì)胞；在纖維化疾病中，可去除導(dǎo)致纖維化的衰老細(xì)胞或活化成纖維細(xì)胞；在傳染病治療上，針對(duì) HIV、乙肝病毒等感染，體內(nèi)細(xì)胞療法具有成本和安全性優(yōu)勢(shì) 。

（二）面臨挑戰(zhàn)

盡管前景廣闊，但該技術(shù)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。例如，如何提高遺傳物質(zhì)向目標(biāo) T 細(xì)胞遞送的效率和特異性，避免脫靶效應(yīng)；如何確定 CAR 表達(dá)的最佳時(shí)長(zhǎng)，維持體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞的功能和持久性；如何應(yīng)對(duì)納米載體轉(zhuǎn)染效率低、病毒載體存在安全風(fēng)險(xiǎn)等問(wèn)題 。此外，還需要深入研究不同疾病適應(yīng)癥下，體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞療法的最佳應(yīng)用方式，并通過(guò)臨床前研究和臨床試驗(yàn)，評(píng)估其安全性和有效性 。

六、未來(lái)展望

CAR 技術(shù)和合成生物學(xué)有望徹底改變醫(yī)學(xué)實(shí)踐。目前，體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞工程技術(shù)在臨床前研究中已展現(xiàn)出與傳統(tǒng)體外生產(chǎn)細(xì)胞相當(dāng)?shù)墓δ埽孕柽M(jìn)一步研究。未來(lái)，需要在免疫健全小鼠模型中深入了解免疫細(xì)胞相互作用和平臺(tái)免疫原性對(duì)連續(xù)給藥的影響，利用免疫缺陷或人源化小鼠以及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型測(cè)試候選藥物的安全性和劑量 - 效應(yīng)關(guān)系 。同時(shí)，還需要多學(xué)科專家合作，共同解決技術(shù)難題，推動(dòng)體內(nèi) CAR-T 細(xì)胞療法早日應(yīng)用于臨床 。

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