摘要：

在抗體的特定位點設計半胱氨酸以產生明確的ADC用于治療癌癥是一種很有前途的方法，可以提高治療指數并有助于簡化制造過程。本文報告了計算機篩選程序的發展，以在抗體中選擇疏水接頭藥物可以偶聯的最佳位點。在抗體的Fab部分天然存在的空腔內確定了位點。將連接子藥物偶聯到這些位點證明了抗體能夠保護連接子-藥物的疏水特性，同時得到的ADC在體外保持其細胞毒性效力。在體內異種移植模型中，位點特異性ADC與隨機偶聯ADC的比較揭示了療效和暴露的改善。還報道了一種選擇性還原劑，它能夠還原工程半胱氨酸，同時使鏈間二硫化物處于氧化狀態。從而能夠生產位點特異性ADC，而不會引入與常規還原/氧化程序相關的雜質，以實現位點特異性偶聯。

【NO.1】介紹：

本文研究者使用計算機模擬方法來選擇疏水有效載荷偶聯的最佳偶聯位點（在IgG1支架中）。通過使用對接程序，我們能夠識別實驗證明能夠屏蔽偶聯duocarmycin有效載荷施加的疏水性的位點。所得ADC的疏水性較低，并且比隨機偶聯的ADC具有更好的性能。此外，在這些研究過程中，我們開發了一種改進的方法來制造這些ADC，該方法依賴于工程半胱氨酸的單步選擇性還原，而不是通常用于這些類型的ADC的兩步還原/氧化方案，這可能導致不需要的副產物。這顯著提高了制造過程的效率和最終ADC的質量。這里介紹的發現為生成具有改進的物理化學特性和穩健可制造性的ADC提供了一個全面的平臺。

【NO.2】結果與討論

1.在計算機中選擇適合疏水性有效載荷偶聯的位點

接頭-藥物vc-seco-DUBA中的seco-duocarmycin有效載荷（圖1）由于其平坦的芳香族結構而是一種疏水分子，將這樣的部分偶聯到抗體上會導致疏水貼片的引入，使所得的ADC比母體抗體更具疏水性。這導致對理化性質（例如聚集）的負面影響和不太有利的藥理學特征（例如，清除率增加），如引言中詳述的那樣。

圖1.duocarmycin接頭-藥物vc-seco-DUBA的結構（A）及其3D模型（B）

我們假設將接頭-藥物放置在抗體與蛋白質有很強相互作用的位置可能會減少源自有效載荷的新引入的疏水表面。據設想，抗體上存在的疏水貼片可以與接頭藥物產生強烈的相互作用，從而用另一個（盡管更大）疏水表面取代已經存在的疏水表面。我們假設，當確定了這些表面時，就可以選擇在該表面附近引入半胱氨酸的合適位點。此外，我們設定了接頭-藥物應在抗體的Fab部分偶聯的條件，因為Fan等人和Zhang等人的工作表明，腫瘤中存在的細胞外蛋白酶能夠切割IgGFc部分的單鏈。因此，接頭-藥物與IgG的Fc部分的偶聯會導致效力喪失。因此，我們使用兩種不同抗體的Fab部分的YASARA蛋白質建模程序創建了同源模型。使用的抗體是基于靶向PSMA的J591抗體的mAb1和基于靶向5T4的H8抗體的mAb2。對于這兩種mAb，使用抗Shh5E1嵌合體的Fab片段的晶體結構作為模板（PDB代碼3MXV）可產生最佳結果。為了便于尋找最佳位點，使用AutoDockVina方法將接頭-藥物對接到這些蛋白質模型上（參見材料和方法）。令人驚訝的是，使用Vina算法將接頭-藥物對接在Fab1（mAb1）的模型上，導致接頭-藥物定位到重鏈和輕鏈之間的空腔中。執行的所有對接運行都導致接頭-藥物定位在Fab腔內。接頭-藥物在Fab1上的對接導致15種獨特的對接構象，計算的結合能在-8.0和-6.9kcal/mol之間變化。為了證明該方法的普遍適用性，Fab2（mAb2）也用于對接到接頭-藥物。同樣，這導致空腔內部排他性排列，具有10種獨特的構象，計算出的結合能在-8.3和-7.3kcal/mol之間（圖2）。

圖2.接頭-藥物對接到抗PSMAFab1（左）和抗5T4Fab2（右）上，導致腔內排他定位

這促使我們尋找合適的位點，以便在Fab腔內或附近引入半胱氨酸殘基。我們選擇了符合以下標準的位點：

（1）位于連接子-藥物的計算馬來酰亞胺位置附近;

（2）靠近Fab腔或位于Fab腔內并指向腔內，這應防止抗體之間形成二硫鍵;

（3）場地殘留物側鏈應處于可觸及的位置;

（4）不太可能參與可能導致抗原親和力降低的強結構相互作用;

（5）不在其他半月氨酸附近。評估具有對接接頭-藥物的Fab1模型揭示了許多潛在位點，如圖3所示。

圖3.Fab1中的潛在附著位點，來自不同對接運行的馬來酰亞胺以紅色顯示

發現Fab1中的以下位點適合用半胱氨酸殘基替代：HC-41S、HC-89V、HC-110T、HC-152E、HC-153P、LC-40P、LC-41G、LC-165E和LC-168S。可變域中的所有位置都由Kabat編號表示，而常數區域中的位置由Eu編號表示。分子建模研究表明，對于mAb2，在Fab中也確定了適合偶聯的相似位置（參見圖1）。

2.Fab腔中duocarmycin有效載荷的偶聯揭示了疏水性屏蔽和良好的聚集行為

為了通過實驗驗證計算機鑒定的接頭藥物與抗體結合的位點的適用性，制備了幾種基于mAb1和mAb2的抗體，這些抗體在擬議位點含有工程半胱氨酸。所有突變蛋白均表達良好且聚集水平低。此外，用位于Fab腔外的半胱氨酸作為對照抗體制成HC-120C突變體。為了制備相應的ADC，使用了一種已知的程序，其中首先用過量的TCEP完全還原抗體（從工程半胱氨酸中去除半胱氨酸或谷胱甘肽帽，同時減少鏈間二硫鍵），然后與氧化劑DHAA重新形成鏈間二硫鍵。將未掩蔽的工程半胱氨酸偶聯到接頭-藥物上，并按照材料和方法部分所述純化所得的ADC。ADC的平均DAR在1.5-1.8之間（由分析型HIC確定）。為了評估ADC的整體疏水性，還采用HIC來分析連接兩種藥物的抗體的保留時間，因為這是存在的主要物種（參見支持信息）。一些典型的疏水層析色譜圖如圖4所示，其中比較了隨機偶聯的ADC、對照HC-120CADC和HC-41CADC（完整跡線見圖2）。

圖4.HIC色譜圖顯示了隨機偶聯的ADC1（上跡線）、位點特異性ADC1HC-120C（中間跡線）和位點特異性ADC1HC-41C（下跡線）的疏水性差異

從HIC譜中可以明顯看出，由于接頭-藥物在抗體的不同附著位點偶聯，這些ADC之間的保留時間（RT）存在差異。由于HIC根據疏水性分離蛋白質，因此得出結論，與隨機偶聯物相比，Fab腔內HC-41C位置的接頭-藥物偶聯導致周圍的蛋白質外套對疏水有效載荷的屏蔽。Benjamin等人觀察到了類似的屏蔽效應，該有效載荷在抗體Fc部分的CH2-CH3結構域形成的空腔中偶聯。有趣的是，HC-120C變體，其中預測有效載荷不會從蛋白質套的屏蔽中受益，因為它指向遠離抗體表面的蛋白質套膜，與隨機偶聯物相比，甚至顯示出更少的屏蔽。表1總結了不同測試突變體的DAR2峰的HIC保留時間。為了便于比較疏水性，參數相對疏水性（RH）定義為RH=（RT達爾2–RT達0）/（RTdar2（隨機）–RTdar0（隨機）).使用這個參數，可以很容易地看出與隨機共軛物相比，工程站點的性能是更好（屏蔽有效載荷）還是更差（暴露有效載荷）。

表1.測試的半胱氨酸工程ADC的HICRT（最小值）、RH、DAR和%HMW

從表1中可以看出，對于計算機對接方法提出的所有站點，相對疏水性（RH）值低于1.0證明了這一點，這證明了明顯的屏蔽效果。HC-41C和LC-41C的RH最低。引人注目的是，LC-40C突變體的屏蔽性低于鄰近的LC-41C，盡管這兩個位點都比隨機偶聯物屏蔽性更強。初步得出結論，除了附著位點外，工程半胱氨酸的方向在蛋白質外套膜對有效載荷施加的屏蔽水平也起著作用。對于mAb2，HC-40C和HC-41C都表現出對有效載荷的屏蔽作用，HC-41C的屏蔽效果更大（類似于mAb1中LC-40C和LC-41C之間的差異）。這些結果表明，在Fab腔中的某個位置屏蔽有效載荷似乎是一個獨立于抗體的一般原則。由于RH為0.3的ADC2HC-41C顯示出最強的疏水性屏蔽，因此決定在一組已用于臨床試驗的13種抗體中進一步評估該位置。發現相應ADC的RH范圍為0.2至0.9，表明對于所有測試的抗體，觀察到有效載荷的屏蔽（表1）。

ADC的另一個關鍵特性是其聚合行為。疏水性有效載荷與抗體的偶聯會導致二聚體和三聚體的形成，這可能會成為工藝開發中的不利因素。對位點特異性ADC的%HMW物質分析顯示，與隨機偶聯相比，在Fab腔內偶聯有效載荷具有明顯的優勢。如表1所示，觀察到所有工程地點的HMW物種百分比較低。然而，由于HC-120C的%HMW物質也很低，因此下降應主要歸因于更容易聚集的隨機偶聯物中不存在較高的DAR（DAR4和DAR6）物種。

vcMMAE和mcMMAFADC還觀察到有效載荷的屏蔽，證明了該概念的普遍性（見表S2和S3）。

3.在IgG1的框架區域2中偶聯不會影響其抗原結合親和力和體外細胞對靶標表達細胞的殺傷活性

HC-40C、HC-41C、LC-40C和LC-41C突變抗體都有一個共同點，即它們的突變位點位于抗體的框架區2（FR2）。Albone等人和Spidel等人之前的工作表明，在抗體中LC-80C的輕鏈框架區域3中偶聯MMAF樣有效載荷是可能的，而不會影響結合親和力，從而產生活性ADC。在我們的案例中，盡管分子模型表明這些位置的半胱氨酸不會顯著扭曲CDR區域，但我們的抗體及其相應的ADC是否仍會與抗原結合并有效殺死表達抗原的腫瘤細胞，還有待觀察。使用細胞結合測定法，證明隨機偶聯的ADC1和位點特異性ADC1HC-41C對PSMA陽性LNCap-C4.2細胞（EC50在0.1–0.2μg/mL范圍內;參見圖S3以獲得示例性的完全結合曲線）。為了進一步評估靶標結合和效力，在PSMA陽性LNCap-C4.2細胞（ADC1突變體）和5T4陽性MDA-MD-468細胞（ADC2突變體）中測試了表1中描述的ADC。令人欣慰的是，如表2所示，與隨機ADC相比，對表達靶標的細胞的體外細胞毒性試驗給出了相似的結果（參見圖S3的示例性全細胞毒性曲線）。所有ADC在靶標陰性細胞（IC50>70nM），表明靶標介導的腫瘤細胞被選擇性殺傷（數據未顯示）。這些實驗表明，與隨機偶聯的ADC相比，在指定位置與疏水有效載荷偶聯不會導致結合親和力和體外細胞毒性的改變。

表2.體外研究半胱氨酸工程ADC的細胞毒性

4.增強半胱氨酸工程ADC的體內抗腫瘤活性

在證明定點特異性ADC在疏水性和%HMW種類方面優于隨機ADC的物理化學性質并且在體外細胞毒性測定中仍然有效后，在小鼠中運行BT-474異種移植模型，以比較一組基于duocarmycin接頭藥物的定點特異性ADC及其各自的隨機偶聯ADC的體內功效。與人類相比，小鼠表達羧酸酯酶1c（CES1c），其快速裂解接頭藥物，導致小鼠中偶聯ADC的清除率非常高，而小鼠中的PK譜與人類無關。因此，在SCID背景下培育的CES1c敲除小鼠中進行了異種移植研究。選擇BT-474異種移植模型，因為該腫瘤對5T4抗原陽性（見圖5B）和PSMA陰性，能夠評估抗原介導的抗腫瘤活性和潛在的非抗原介導作用。決定只關注HC-41CADC，因為疏水性數據顯示HC-41C具有最佳的疏水性屏蔽能力，RH為0.3。單劑量3mg/kg靶向5T4的ADC誘導位點特異性ADC2HC41C的腫瘤消退，這與在隨機偶聯ADC中觀察到的腫瘤生長延遲形成鮮明對比（圖5A）。相比之下，PSMA靶向的ADC僅顯示邊際效應，這與之前報道的非結合同種型對照ADC的活性一致，并且對于本實驗中其他非結合同種型對照vc-seco-DUBA的ADC一致（數據未顯示）。對于靶向5T4的ADC（ADC2），與隨機偶聯的ADC相比，位點特異性HC-41CADC導致抗腫瘤反應顯著改善。

圖5.（A）ADC2HC-41C在BT-474異種移植模型中的體內活性。（B）顯示5T4靶標表達的腫瘤的免疫組織化學表征；（C）位點特異性ADC和隨機偶聯ADC的藥代動力學

為了更深入地了解療效提高背后的機制，進行了藥代動力學（PK）研究，以獲取有關ADC在CES1C敲除小鼠中暴露的信息。如圖5C和表3所示，位點特異性偶聯的ADC2HC-41C顯示出更長的半衰期（t1/2），并且由于清除率（CL）較低，與隨機偶聯的ADC2相比，暴露量大約高2倍。Cmax和分布容積（VSS）值相似。

表3.ADC2隨機和ADC2HC-41C的PK參數

5.通過引入選擇性還原步驟來改進制造過程

在這些研究過程中，我們發現使用前面描述的還原/氧化方案生成位點特異性ADC(14)導致鏈間二硫鍵再氧化時出現大量二硫鍵加擾（鏈間二硫鍵的重新形成不正確）。我們發現形成的二硫鍵加擾產物是由輕鏈和重鏈組成的半抗體，其中鉸鏈二硫鍵沒有在重鏈之間正確形成，而是在一個重鏈內的兩個半胱氨酸之間形成。由于我們認為DHAA的再氧化會導致半抗體的形成，因此我們試圖限制還原劑的量，以便選擇性地還原HC-41半胱氨酸并保持鏈間二硫鍵完好無損。然而，研究發現TCEP對HC-41C的工程半胱氨酸沒有偏好，因為用2當量的TCEP處理加帽抗體，然后與接頭-藥物偶聯，導致隨機和HC-41C偶聯物種的混合物。為了獲得選擇性還原，其中僅還原工程半胱氨酸而鏈間二硫鍵保持完整，我們推斷更疏水性的膦可能更傾向于還原HC-41C，因為它可以在Fab腔內結合，類似于ADC中接頭-藥物的結合。我們開始測試一小部分市售的三苯基膦衍生物1-4，如圖6A所示。

圖6.（A）磺酰化三苯基膦的選擇性半胱氨酸還原測試。（B）未還原的SDS-PAGE凝膠顯示還原劑2的選擇性，因為在室溫下將加帽抗體與32當量還原劑孵育8天后，未觀察到重鏈（H）或輕鏈（L）條帶。

一個或多個磺酰基的存在確保了膦可溶于水和緩沖液。在篩選了對鏈間二硫鍵的選擇性和反應性后，我們發現還原劑2，稱為2-（二苯基膦基）苯磺酸（diPPBS），符合我們的標準。值得注意的是，通過非還原性SDS-PAGE分析，將加帽抗體與32倍過量的還原劑2孵育8天不會導致任何可檢測量的游離輕鏈或重鏈。與此形成鮮明對比的是，其他被測試的還原劑（1、3和4）在這些條件下顯示二硫鍵完全還原，僅存在重鏈和輕鏈帶證明了這一點（圖6B）。顯然，磺酰基與膦鄰位對于選擇性還原至關重要，因為還原劑1、3和4具有meta和para取代，不表現出選擇性行為。我們能夠通過RP-HPLC監測選擇性還原的進展，因為加帽和未加帽抗體被證明具有不同的保留時間。在篩選出最佳的選擇性還原條件后，我們發現pH值和還原劑濃度是對還原反應動力學影響最大的參數（參見圖S4）。通過改變pH值和還原劑的用量，我們得出結論，pH5是最佳pH值，16-32當量還原劑足以在約16小時內完成還原，適合在GMP生產過程中應用。

盡管嘗試通過結構改變進一步優化還原劑2，但我們無法在反應速率和使用的當量方面進行改進。通過使用優化條件，如材料和方法部分所述，與還原/氧化方案相比，可以生成在DAR（1.8）和%HMW（1-2%）物質方面相似但在存在的半抗體量方面顯著不同的ADC。如圖7所示，還原/氧化方案導致半抗體產物增加，如未還原的SDS頁面所示，條帶為75kDa（圖7C，泳道2）。該頻段在ADC中沒有增加，這是由選擇性還原方案引起的（圖7C，泳道3）。

圖7.（A）使用還原/氧化方案形成加擾產物。（B）加帽抗體的選擇性還原不會導致產物被打亂。（C）未還原的SDS-PAGE，顯示加帽抗體（泳道1）、使用還原/氧化方案制備的ADC（泳道2），在75kDa處具有透明條帶，以及使用選擇性還原方案形成的ADC（泳道3）。

圖S5顯示了還原/氧化方案和選擇性還原方案得到的ADC之間的并排分析比較（HIC、SEC和RP-HPLC）。除了提高產品質量外，使用新發現的選擇性還原劑還減少了特定位點ADC制造過程中的工藝步驟數量。無需使用DHAA進行再氧化步驟，這在工藝表征和物流方面非常有益。此外，使用TCEP跟蹤工程半胱氨酸的還原過程需要分析MS方法，而現在可以使用方便的RP-HPLC方法跟蹤工程半胱氨酸的還原過程，該方法允許進行簡單的過程控制測量并加快抗體特異性過程優化。

【NO.3】結論

本文表明通過使用計算機對接方法，鑒定了用于偶聯有效載荷的新IgG半胱氨酸突變體。無一例外，對接運行將接頭-duocarmycin放置在天然存在于IgG抗體Fab部分的空腔內。提出了引入半胱氨酸突變的幾個位置，這些工程位點與接頭-藥物的偶聯導致ADC的疏水性低于相應的隨機DAR2偶聯物質。此外，聚集趨勢非常低，如存在的少量高分子量物質所示。據推測，（部分）疏水有效載荷被Fab腔與周圍環境屏蔽，導致ADC的整體疏水性降低。在測試的一組突變體中，在可變部分的框架區域2中鑒定出一個子集（HC-40C、HC-41C、LC-40C和LC-41C），該子集具有相應的ADC，具有高效的接頭-藥物偶聯、少量的高分子量物質和明顯的屏蔽效應，其中HC-41C是更優的位點，因為該位點的RH低至0.3。盡管在可變部分的這些位點偶聯了疏水有效載荷，但ADC與其靶抗原的結合得以保留，體外細胞殺傷實驗表明，這些突變體在殺死癌細胞方面與隨機偶聯的對應物一樣有效。采用表達靶標的BT-474細胞的探索性體內異種移植模型顯示，與隨機偶聯ADC相比，定點共軛ADC的抗腫瘤反應有所改善，這與定點特異性ADC的暴露量增加2倍一致與隨機偶聯物相比。

最后，盡管使用TCEP/DHAA還原/氧化的半胱氨酸工程ADC的制造工藝是眾所周知的并得到廣泛應用，但我們發現，完全還原抗體的DHAA再氧化步驟會導致形成擾亂的二硫鍵物質，半抗體的形成證明了這一點。受在抗體的Fab腔中引入疏水有效載荷時觀察到的屏蔽效應的啟發，我們確定了一種還原劑2-二苯基膦基苯磺酸（diPPBS），它對鏈間二硫鍵沒有還原能力，但能夠在一夜之間以穩健的方式還原Fab腔中的（加帽）工程半胱氨酸。這導致最終產品中沒有加擾的二硫化物物質，并總體簡化了制造過程。我們相信，這個新開發的平臺使我們能夠產生帶有疏水有效載荷的高質量ADC，這些ADC可以以穩健和簡單的方式制造，這將為癌癥治療帶來更有效的靶向療法。SYD1875是一種靶向5T4的ADC，采用vc-seco-DUBA在HC-41C位點特異性偶聯，已在GMP條件下使用選擇性還原工藝生產，目前正在進行晚期實體瘤的臨床試驗（ClinicalTrials.gov標識符：NCT04202705）。

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