? 研究背景

傷口愈合需經歷止血、炎癥、增殖和重塑這一涉及不同組織和細胞協調作用的復雜且高度程序化的過程。其中，免疫微環境的調節是傷口愈合的關鍵組成部分，免疫微環境失調會導致傷口在炎癥期停滯不前，并通過抑制肉芽組織形成、新生血管形成和再上皮化來阻礙愈合過程，留下纖維化增生或影響組織功能的疤痕。

近年來，水凝膠被廣泛用于 3D 細胞培養和組織工程，并且可以模擬細胞外基質的再生微環境，因此， 可以通過將適當的藥物或生物活性分子引入凝膠系統來開發具有獨特生物活性的傷口敷料。PEG、PLGA、PCL 等合成聚合物的衍生物具有良好的生物相容性和生物降解性，并且生理活性相對惰性，不易干擾正常的生理環境，是醫用水凝膠的主要來源。另外，廣泛使用的天然多糖具有內在的生物活性，有利于微環境調節，促進傷口修復。尤其是黃芪多糖 （APS），具有抗炎、抗氧化和收斂作用，廣泛可用且成本低，可將其設計到用于組織修復的水凝膠的三維網絡系統中。姜黃素 （Cur）也可用于創傷性關節炎、抗腫瘤和傷口愈合等方面，但其穩定性低、水溶性低且在高局部濃度下

具有毒性，限制了其廣泛應用。

目前，中藥部件的自組裝成為熱門的研究課題，尤其是在皮膚修復材料方面，由草藥、特定化學物質和草藥囊泡的活性成分組裝形成的納米纖維或水凝膠顯示出更多的生物相容性和活性優勢。

? 主要內容

基于此，中國科學院韓東、敖卓團隊開發了一種基于天然聚合物的多功能復合水凝膠系統（OCS/NX@Cur），由氧化黃芪多糖、羧甲基殼聚糖與鎂離子交聯的甲基丙烯酸海藻酸鈉通過席夫堿反應構建可注射水凝膠骨架，并結合負載姜黃素的牛膝衍生超分子自組裝體實現藥物遞送。該體系采用兩步固化策略：初始可注射態自適應填充組織缺損，隨后經紫外光誘導共價交聯增強組織粘附性；姜黃素通過薄膜分散技術均勻負載于超分子結構中，隨水凝膠降解逐步釋放至傷口微環境。實驗表明，該生物活性復合材料通過天然成分的協同作用及姜黃素的緩釋效應，展現出顯著的抗炎、抗氧化及血管生成促進作用，為慢性傷口治療提供了創新型功能敷料方案。

Scheme

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NX@Cur 的制造和表征
通過乙醇溶解-紡絲工藝，將Cur均勻封裝于從牛膝中提取的球形超分子結構（NX SSA，直徑約1.87μm）中，形成厚度增至2.69μm的核殼結構（圖1A,F,G）。電位分析證實負載過程未改變體系負電性（圖1B）；紅外光譜（FT-IR）顯示Cur酚羥基特征峰（3510 cm?1）及紫外吸收峰紅移（442nm），表明Cur與NX SSA存在π-π相互作用（圖1C,D）；掃描電鏡（SEM）與透射電鏡（TEM）觀察顯示Cur封裝后顆粒尺寸增加且衍射環消失，X射線衍射（XRD）進一步驗證Cur由晶體轉變為非晶態（圖1E,H）；能量色散光譜（EDS）檢測到鈣元素存在，揭示NX SSA的生物礦物成分。所有表征結果共同證明，NX SSA通過抑制Cur結晶顯著增強了其分散性，為構建功能性藥物遞送系統提供了結構基礎。

Figure 1、 （A） NX@Cur 制備示意圖。（B） 載藥前后的電位值。（C） NX、Cur 和 NX@Cur 的紅外光譜。（D） NX、Cur 和 NX@Cur 的紫外光譜。（E） NX、Cur 和 NX@Cur 的 X 射線衍射圖樣。（F） NX、Cur 和 NX@Cur 的掃描電子顯微照片。（比例尺：5 μm。（G） NX 和 NX@Cur 的粒度分布統計。（H） NX、Cur 和 NX@Cur 的透射電子顯微照片和電子衍射圖譜。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

OCS/NX@Cur 水凝膠的合成和表征

以氧化黃芪多糖（OAPS）、羧甲基殼聚糖（CMC）和甲基丙烯酸海藻酸鈉（SAMA）交聯鎂離子（Mg2?）構建，通過席夫堿反應與紫外光交聯兩步法制備。該水凝膠展現出良好的可注射性、機械強度、低溶脹率（72小時溶脹率1.41倍）及組織粘附性，其性能通過核磁共振波譜（NMR）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）及流變實驗得到驗證。進一步負載牛膝衍生超分子自組裝體（NX@Cur）后，水凝膠實現姜黃素（Cur）的緩釋，且藥物加載未改變水凝膠孔隙結構，反而通過氫鍵作用降低溶脹率至58%，并顯著延緩Cur釋放速率（第6天釋放率52.66%）。體外降解實驗表明，OCS/NX@Cur水凝膠在20天內降解71.30%，符合傷口敷料需求。該體系通過天然多糖的協同作用及藥物緩釋效應，為慢性傷口治療提供了兼具生物活性與可控釋放功能的創新型敷料方案。

Figure 2、 （A） OCS/NX@Cur 水凝膠的制備示意圖。（B） OCS 和 OCS/NX@Cur 水凝膠的掃描電子顯微照片。（C） 水凝膠的可注射性和兩個凝膠階段的光學圖像的演示。（D） 水凝膠粘附在器官或皮膚上。（E） 粘附在皮膚上的水凝膠被彎曲或扭曲和拉伸的照片。（F） 水凝膠粘附在豬皮膚上的剪切力-距離曲線。（G） OCS UC 和 OCS 水凝膠的粘度-剪切速率曲線。（H） OCS UC 和 OCS 水凝膠的模量-角頻率曲線。（I） OCS 和 OCS/NX@Cur 水凝膠的抗壓強度-應變曲線。（J） OCS 和 OCS/NX@Cur 水凝膠在不同時間的溶出速率。（K） OCS 和 OCS/NX@Cur 水凝膠在不同時間的降解速率。（L） Cur、NX@Cur 和 OCS/NX@Cur 的藥物釋放曲線。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

OCS/NX@Cur 水凝膠的生物相容性

體外細胞實驗表明，NX@Cur在0.5-18.75μg/mL濃度范圍內對Raw264.7巨噬細胞無毒副作用，而成纖維細胞L929在≤75μg/mL濃度下保持正常增殖，僅高濃度（≥150μg/mL）產生抑制作用；水凝膠提取物經死/活染色顯示，培養第1天和第5天均未見顯著細胞死亡（紅色熒光極少），證實OCS基質良好的細胞相容性。血液相容性測試中，溶血率低于5%且上清液澄清，表明材料無溶血風險。大鼠體內實驗進一步顯示，治療14天后主要器官（心、肝、脾、肺、腎）未見組織腫大或炎癥浸潤，且體重無顯著變化，證明該體系具備優異的體內生物安全性。綜合實驗結果支持OCS/NX@Cur水凝膠作為安全有效的生物活性傷口敷料的應用潛力。

Figure 3、 （A） Raw 264.7 在不同濃度 NX@Cur 處理后的細胞活力。（B） 成纖維細胞 L929 在不同濃度 NX@Cur 處理后的細胞活力。（C） 與 OCS 和 OCS/NX@Cur 水凝膠提取物共孵育 1 天和 5 天后 L929 細胞的死活熒光染色。（比例尺：100 μm）（D） NX@Cur、OCS 和 OCS/NX@Cur 水凝膠的溶血率和溶血照片。（E） 用或不用 OCS/NX@Cur 水凝膠處理 14 天的大鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟的 H&E 染色。（比例尺，200 μm）。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

體外抗炎和抗氧化作用

OCS/NX@Cur復合水凝膠通過調控巨噬細胞極化及清除活性氧（ROS）實現抗炎-抗氧化協同作用。體外實驗表明，NX@Cur以濃度依賴性方式下調LPS誘導巨噬細胞的M1標志物CD86表達，上調M2標志物CD206表達，在37μg/mL濃度下顯著逆轉M1/M2表型比例（圖S9）。免疫熒光染色證實，OCS/NX@Cur治療組使炎癥巨噬細胞CD11c熒光強度降低8.37%（p<0.001），同時CD206表達增強16.2%（p<0.001），M2/M1比值較單藥組進一步提升（圖4A-C），證明水凝膠載體可增強NX@Cur的免疫調節效能。此外，該體系通過姜黃素緩釋有效清除H?O?誘導的成纖維細胞內ROS，DCFH-DA熒光染色顯示治療組氧化應激水平恢復至正常狀態（圖4D）。研究證實，OCS/NX@Cur水凝膠通過誘導巨噬細胞向促修復M2表型轉化及抗氧化應激的雙重機制，重塑傷口免疫微環境，為慢性難愈性傷口治療提供了兼具靶向免疫調控與氧化應激干預功能的先進敷料策略。

Figure 4、 （A） 24 小時時 CD11c（綠色）和 CD206（紅色）免疫熒光染色的代表性圖像（比例尺：30 μm）。（B） 免疫熒光染色結果中 Raw 264.7 細胞中 CD11c（綠色）和 CD206（紅色）表達的平均熒光強度。（C） 免疫熒光染色結果中 M2/M1 表達的相對值。（D） 成纖維細胞 L929 細胞中 ROS 水平熒光染色的代表性圖像（比例尺：100 μm）。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

體外細胞遷移和血管生成效應

通過細胞劃痕試驗與體外成管實驗，評估了OCS/NX@Cur復合水凝膠對細胞遷移及血管生成的促進作用。實驗表明，NX@Cur、OCS凝膠及OCS/NX@Cur均顯著增強成纖維細胞遷移能力，其中OCS/NX@Cur組在72小時遷移率較對照組提升24.59%（p<0.001），而單純OCS組與對照組無顯著差異，證實NX@Cur為促進細胞遷移的關鍵活性成分。在血管生成評估中，NX@Cur與OCS/NX@Cur組均顯著增加人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）的血管節點數（分別提升1.27倍和0.89倍）及總管長（分別延長0.93倍和0.48倍），但OCS組與對照組無統計學差異。進一步分析發現，NX@Cur組6小時內藥物釋放量（3.99%）是OCS/NX@Cur組（0.13%）的30.69倍，表明水凝膠包封通過緩釋機制避免局部藥物濃度過載，盡管初期釋放延遲，但長期釋放效能（第10天達47.41%）仍支持其體內促血管生成潛力。研究證實，該復合體系通過NX@Cur的生物活性與水凝膠控釋功能的協同作用，有效調控細胞遷移與血管新生，為后續動物實驗提供了體外機制支持。

Figure 5、 （A） 劃痕測定，以評估 HUVECs 與不同材料共孵育后的遷移能力。（比例尺：200 μm）（B） 通過劃痕測定定量細胞遷移速率。（C） HUVEC 與水凝膠提取物共孵育 6 小時后形成的試管圖像。（比例尺：300 μm）（D） Nb 節點的定量。（E） 試管總長的定量。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

OCS/NX@Cur 的體內皮膚缺損傷口愈合功效

通過建立大鼠全皮膚缺損模型，驗證了OCS/NX@Cur復合水凝膠的體內治療效果。實驗設置對照組（生理鹽水）、NX@Cur組、OCS組及OCS/NX@Cur組，結果顯示復合水凝膠組傷口愈合速率顯著優于其他組（圖6B-D）。第3天時，OCS/NX@Cur組傷口收縮率達51.81%，較對照組提升35.92%（p<0.05）；至第10天，其收縮率進一步增至95.44%，分別較NX@Cur組、OCS組及對照組提高18.55%、7.14%和18.55%（p<0.001）。該結果證實復合體系通過協同作用顯著加速傷口閉合，為臨床轉化提供了直接證據。

Figure 6、 （A） 全層皮膚缺損模型的建立和處理示意圖。（B） 不同時間點傷口的代表性圖片。使用標準金屬定位環（內徑 15 mm）進行傷口成像，其邊緣提供尺寸參考。（比例尺：5 毫米）（C） 傷口隨時間變化的面積圖。（D） 不同治療方案在不同時間點的傷口收縮率。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

組織學分析進一步揭示了OCS/NX@Cur的治療優勢。第7天H&E染色顯示，復合水凝膠組炎癥細胞浸潤顯著減少，并觀察到新生血管形成（藍色箭頭）及毛囊再生（綠色箭頭），而對照組仍存在殘余結痂（黃色箭頭）及大量炎癥細胞（圖7A）。Masson染色證實，OCS/NX@Cur組在第7天即表現出明顯的傷口收縮效應（黑色箭頭），至第14天形成更密集、排列有序的膠原纖維（圖7B）。偏振光顯微鏡結合天狼星紅染色顯示，復合水凝膠組I型膠原沉積量在第7天和第14天分別增加9.00%和25.69%，III型膠原減少8.14%，I/III型膠原比值顯著高于對照組（1.74 vs. 0.22，p<0.01），表明其可促進膠原類型有序轉化，改善瘢痕形成質量。

Figure 7、 （A） 第 7 天和第 14 天的傷口組織 H&E 染色。（比例尺：200 μm）（B） 第 7 天和第 14 天傷口組織的 Masson 染色。（比例尺：200 μm）。

機制研究表明，OCS/NX@Cur的促愈合作用與巨噬細胞極化調控及膠原代謝重塑密切相關。復合水凝膠組M2/M1巨噬細胞比值顯著升高（29.37 vs. 2.04，p<0.01），而M2型巨噬細胞可通過激活TGF-β/Smad通路抑制膠原降解，并促進成纖維細胞合成I型膠原。相關性分析顯示，I/III型膠原比值與M2/M1比值呈強正相關（r2=0.83），揭示免疫微環境調控與膠原重塑的協同效應。此外，NX@Cur的緩釋特性避免了局部藥物濃度過載，使OCS/NX@Cur組在長期治療中維持穩定的抗炎-促修復平衡，最終實現與健康皮膚相似的成熟膠原結構。

Figure 8、 （A） 在明場和偏振光顯微鏡下用天狼星紅染色的第 7 天和第 14 天的傷口組織圖像。（比例尺：500 μm）（B） 第 7 天和第 14 天傷口組織中 III 型膠原的定量。（C） 第 7 天和第 14 天傷口組織中 I 型膠原的定量。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

OCS/NX@Cur 的體內免疫調節和血管生成功效

通過大鼠傷口模型揭示了OCS/NX@Cur復合水凝膠的免疫調節與血管新生協同機制。ELISA檢測顯示，治療組傷口組織中促炎因子IL-6和TNF-α表達顯著降低（分別下降59.50%-86.79%和29.84%-59.29%，p<0.05-0.01），同時免疫熒光染色證實M2型巨噬細胞標志物CD206表達增強（最高達2.01倍，p<0.001），M1型標志物iNOS減少80.49%（p<0.05），M2/M1比值較對照組升高13.42倍（p<0.01），表明體系通過誘導巨噬細胞向促修復表型極化重塑免疫微環境。CD31免疫組化染色進一步顯示，NX@Cur組與OCS/NX@Cur組新生血管密度顯著增加（分別提升56.86%和89.07%，p<0.01-0.001），且血管生成與M2極化趨勢一致，提示M2型巨噬細胞可能通過分泌VEGF等因子協同促進血管新生。研究證實，該體系通過姜黃素緩釋維持長效抗炎作用，并結合水凝膠載體實現免疫調控與組織修復的時空耦合，為慢性傷口治療提供了兼具免疫微環境重塑與血管化促進功能的創新策略。

Figure 9、 （A） 第 7 天傷口組織中 iNOS 和 CD206 免疫熒光染色的代表性圖像。（比例尺：100 μm）（B） 免疫熒光染色結果中 iNOS 和 CD206 表達的平均熒光強度。（C） 免疫熒光染色結果中 M2/M1 表達的相對值。（D） 免疫組織化學染色結果中 CD31 表達相對覆蓋面積的半定量分析。（E） 第 7 天傷口組織 CD31 免疫組織化學染色的代表性圖像（比例尺：100 μm）。數據以 SD ±平均值報告（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，n ≥ 3）。

參考文獻

Mingyuan Zhao、Jiawei Xiang、Yuan Meng、Huizhen Sun、Wenxiao Yang、Zhongxian Li、Kai Li、Qiang Zhang、Zhuo Ao、Dong Han
Astragalus Polysaccharide Hydrogels with Drug-Carrying Super Self-Assembly from Natural Herbs Promote Wound Healing

DOI: 10.1021/acsnano.5c03744