順鉑是當(dāng)前臨床上用于治療多種惡性腫瘤最有效的鉑類藥物之一[1-3]，但長期應(yīng)用會產(chǎn)生較為嚴(yán)重的肝腎毒性、胃腸功能障礙以及聽覺毒性等[4]。由于小腸的解剖位置和生理特性具有寬表面積、高細(xì)胞周轉(zhuǎn)率等特征，小腸對順鉑等化療藥物的不良反應(yīng)高度敏感[5]，其中以十二指腸不良反應(yīng)尤為明顯，臨床上以胃腸道黏膜損傷、胃腸動力延遲、惡心、嘔吐和腹瀉為主要癥狀[6-7]。研究表明，順鉑誘發(fā)的胃腸毒性主要與腸機(jī)械屏障，氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及線粒體功能等機(jī)制有關(guān)[8-9]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator- 1α，PGC-1α）和腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）是評價線粒體功能的主要調(diào)控因子，AMPK能促進(jìn)PGC-1α的激活，進(jìn)而調(diào)控線粒體自噬、凋亡及炎癥反應(yīng)的發(fā)生[10]，對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和腸黏膜屏障功能有關(guān)鍵作用[11]。PGC-1α能通過調(diào)節(jié)線粒體自噬，清除受損線粒體，從而維持線粒體的結(jié)構(gòu)與功能完整性。當(dāng)PGC-1α表達(dá)降低時，線粒體自噬作用減弱，線粒體功能受損，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[12]。

人參皂苷Rh4是三醇型人參皂苷Rg1經(jīng)糖苷鍵斷裂、異構(gòu)化所產(chǎn)生的稀有皂苷，具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[13]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷Rh4在清除炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡、恢復(fù)線粒體功能等方面發(fā)揮獨特功效[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，人參活性成分人參皂苷和酚酸能顯著抑制由X射線（10 Gy）引起的腸隱窩細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腸隱窩細(xì)胞增殖，并激活Wnt/β-catenin信號通路，從而改善腸道損傷[16-17]，初步揭示了人參皂苷的腸道保護(hù)活性。本研究通過構(gòu)建順鉑致腸道損傷模型，以小鼠十二指腸為研究對象，腸黏膜屏障損傷為切入點，深入探究人參皂苷Rh4改善順鉑致腸道損傷的藥效作用以及修復(fù)腸黏膜屏障功能的作用機(jī)制。

1材料

1.1動物與細(xì)胞

SPF級雄性ICR小鼠40只，體質(zhì)量22～25 g，由長春億斯實驗動物有限公司提供，合格證號SCXK（吉）2021-0012。動物飼養(yǎng)于恒溫（22±2）℃、12 h明暗循環(huán)的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動物實驗經(jīng)北華大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號BH-2023-009）。

腸隱窩上皮細(xì)胞（IEC-6）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2藥品與試劑

人參皂苷Rh4從紅參中分離純化得到，為實驗室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.5%；順鉑（批號B24464，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）ELISA試劑盒（批號TW9514）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號TW56961）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號TW47851）購自上海通蔚實業(yè)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號A003-1-2）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（批號A005-1-2）、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒（批號A007-2-1）、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購自南京建成生物研究所；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（批號C1062M）、JC-1線粒體膜電位測定試劑盒（批號C2005）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010）、Hoechst 33258染色試劑盒（批號C1011）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫熒光染色SABC-DyLight44染液試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；胎牛血清（批號PWL217-4）、DMEM高糖培養(yǎng)基（批號MA0212-2）、胰酶（批號MA0232）、青霉素-鏈霉素溶液（批號PWL062）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）抗體（批號HL1185）、Occludin抗體（批號EPR20992）、PGC-1α抗體（批號EPR25162-281）、p21抗體（批號EPR3993）、p53抗體（批號PAb240）、p-AMPK抗體（批號EPR3051）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-I/II（microtubule-associated protein light chain 3-I/II，LC3-I/II）抗體（批號EPR18709）、β-actin抗體（批號1A4）購自英國Abcam公司；自噬蛋白3（autophagy-related protein 3，Atg3）抗體（批號3415）、Atg5抗體（批號12994）、Atg7抗體（批號2631）、Atg14抗體（批號5504）、Beclin-1抗體（批號3495）、p-Beclin-1抗體（批號8496）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體（批號2983）、Unc-51樣激酶1（Unc-51-like autophagy activating kinase 1，ULK1）抗體（批號8654）、p-mTOR抗體（批號5536）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號9662）、Caspase-9抗體（批號9508）、cleavedCaspase-3抗體（批號9664）、cleaved Caspase-9抗體（批號9509）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號2772）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號15071）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號2118）、p-ULK1抗體（批號14202）、Parkin抗體（批號2135）、AMPK抗體（批號2532）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）抗體（批號4280）購自美國CST公司。

1.3儀器

BP211D型分析天平（德國Sartorius公司）；Heraeus Multifuge X3R型高速冷凍離心機(jī)、VLBLATGD2型Varioskan? LUX多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DL-820E型智能超聲波提取器（上海之信儀器有限公司）；IKAT10型手持勻漿機(jī)（德國IKA公司）；TB-718E型生物組織自動包埋機(jī)（湖北泰維科技實業(yè)有限公司）；RM2235型石蠟切片機(jī)、DM750型光學(xué)顯微鏡、TCSSP8型熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

2方法

2.1動物分組、造模、給藥與取材

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組、順鉑組和順鉑＋人參皂苷Rh4低、高劑量（10、20 mg/kg）組，每組10只。由于目前臨床上尚無針對順鉑致腸道損傷的特效藥物，故本研究未設(shè)置陽性對照藥物。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和順鉑組ig等體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥9 d。第7天給藥1 h后，除對照組外，其余小鼠單次ip順鉑（20 mg/kg）誘發(fā)腸損傷模型。于第10天取材，造模及取材前禁食不禁水，每天記錄小鼠體質(zhì)量。小鼠ip 3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）麻醉，腹主動脈采血，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，分離血清，用于DAO活性及TNF-α、IL-1β水平的測定。分離出與胃相連的十二指腸，觀察其病理形態(tài)；切斷與胃相連約2 cm處的十二指腸，取一小段于4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續(xù)組織病理學(xué)染色，其余部分用生理鹽水洗凈后迅速冷凍于?80 ℃，用于后續(xù)組織勻漿以及Western blotting實驗。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)

IEC-6細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48 h更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時用于后續(xù)實驗。

2.3細(xì)胞活力測定

IEC-6細(xì)胞以5×104個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，待其生長形態(tài)飽滿、密度約80%開始實驗，加入不同濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00 μmol/L）的順鉑或不同濃度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000 μmol/L）的人參皂苷Rh4處理24 h，另設(shè)置不含藥物的對照組。PBS洗滌2次，加入MTT溶液（5 mg/mL），采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（A）值，計算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力＝A實驗/A對照

為考察人參皂苷Rh4對順鉑誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞活力的影響，設(shè)置對照組、順鉑組和順鉑＋人參皂苷Rh4（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000 μmol/L）組。各給藥組加入不同濃度的人參皂苷Rh4處理24 h，棄去上清液，再加入順鉑（1 μmol/L）處理24 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，測定細(xì)胞活力。在確定最佳給藥劑量后，再探究人參皂苷Rh4（10 μmol/L）在不同處理時間（1、3、6、12、24 h）下對順鉑誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞活力的影響。

2.4細(xì)胞分組和處理

設(shè)置對照組、人參皂苷Rh4（10 μmol/L）、順鉑組和順鉑＋人參皂苷Rh4（2.5、5.0、10.0 μmol/L）組。各給藥組加入不同濃度的人參皂苷Rh4處理24 h，棄去上清液，再加入順鉑（1 μmol/L）處理24 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。

2.5生化指標(biāo)測定

取“2.1”項下小鼠十二指腸組織，制備組織勻漿液，按照試劑盒說明書測定氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平和CAT、GSH-Px活性。取“2.1”項下小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書測定血清中DAO活性和TNF-α、IL-1β水平。

2.6 HE染色觀察十二指腸病理變化

取“2.1”項下小鼠十二指腸組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，每組隨機(jī)取出3個十二指腸組織進(jìn)行石蠟包埋，切成5 μm厚的組織切片，置于載玻片上，經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟和水化處理后，進(jìn)行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察十二指腸的絨毛斷裂以及隱窩深度改變等病理學(xué)情況，并對十二指腸病理學(xué)變化進(jìn)行評分[18]。

2.7 Hoechst 33258染色檢測十二指腸組織細(xì)胞凋亡情況

取“2.1”項下小鼠十二指腸組織切片，經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟和水化處理后，加入Hoechst 33258染液（10 μg/mL）避光染色5 min，PBS洗滌3次，利用抗熒光猝滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下檢測十二指腸細(xì)胞凋亡情況[19]。

2.8免疫熒光染色檢測十二指腸NF-κB表達(dá)

取“2.1”項下小鼠十二指腸組織切片，經(jīng)脫蠟和脫水處理后，滴加NF-κB抗體（1∶400），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌，滴加熒光標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min后，用SABC-CY3（1∶100）再次標(biāo)記。采用DAPI染色細(xì)胞核，于熒光顯微鏡下觀察NF-κB蛋白表達(dá)情況，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光強(qiáng)度[20]。

2.9線粒體膜電位的測定

按“2.4”項下方法進(jìn)行分組和處理，每孔加入500 μL JC-1工作液，37 ℃孵育20 min；棄去上清液，用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次，于熒光顯微鏡下觀察并拍照[21]。

2.10流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡情況

按“2.4”項下方法進(jìn)行分組和處理，收集對照組、順鉑組、順鉑＋人參皂苷Rh4組IEC-6細(xì)胞，采用磷酸鹽緩沖液洗4次，每組加入450 μL結(jié)合緩沖液混懸；加入9.0 μL AnnexinV-FITC試劑，混勻，26 ℃避光孵育30 min；加入9 μL PI試劑，26 ℃避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各組IEC-6細(xì)胞的凋亡情況[22]。

2.11 Western blotting檢測緊密連接蛋白、線粒體自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

取“2.1”項下小鼠十二指腸組織和“2.4”項下處理的IEC-6細(xì)胞，加入RIPA裂解液，于冰上提取總蛋白，4 ℃、3 500 r/min離心后，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，沸水浴加熱使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入ZO-1、Occludin、PGC-1α、p21、p53、p-AMPK、LC3-I/II、Atg3、Atg5、Atg7、Atg14、Beclin-1、p-Beclin-1、mTOR、ULK1、p-mTOR、Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2、β-actin和GADPH抗體（一抗稀釋比例1∶1 000，內(nèi)參稀釋比例1∶5 000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次后，加入二抗，室溫孵育2 h；加入ECL發(fā)光液顯影，用凝膠成像儀曝光，并使用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

2.12統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以 表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖。

3結(jié)果

3.1人參皂苷Rh4對順鉑致小鼠腸損傷模型體質(zhì)量、腸組織形態(tài)變化以及腸黏膜屏障功能的影響

如圖1-A所示，小鼠ip順鉑后，胃內(nèi)食物殘留量明顯增多，十二指腸部位的腸壁明顯變白、變薄，同時伴有較為明顯的充血癥狀，表明順鉑對小腸的損傷部位主要體現(xiàn)在十二指腸。如圖1-B所示，與對照組比較，小鼠于第7天ip順鉑后，體質(zhì)量明顯下降，而人參皂苷Rh4（10、20 mg/kg）能不同程度地緩解順鉑致小鼠體質(zhì)量的下降。十二指腸組織HE染色（圖1-C）結(jié)果顯示，對照組小鼠腸絨毛結(jié)構(gòu)清晰，隱窩排列整齊且深度較高；順鉑組十二指腸組織顯現(xiàn)出明顯的病理性損傷，如隱窩損傷嚴(yán)重及炎癥反應(yīng)導(dǎo)致絨毛長度減少（P＜0.05、0.01）；人參皂苷Rh4預(yù)處理能明顯減輕隱窩損傷數(shù)目，且絨毛長度較順鉑組保留較好（P＜0.01）。腸黏膜屏障功能是順鉑誘導(dǎo)腸損傷的主要特征，DAO以及腸黏膜機(jī)械屏障相關(guān)蛋白（ZO-1和Occludin）是評價其功能的主要指標(biāo)，是體現(xiàn)腸黏膜損傷重要依據(jù)。如圖1-D、E所示，與對照組比較，順鉑組小鼠血清中DAO活性顯著升高（P＜0.01），緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），表明順鉑能誘發(fā)腸黏膜損傷，破壞腸黏膜屏障功能；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4預(yù)處理后小鼠血清中DAO活性顯著降低（P＜0.05、0.01），ZO-1和Occludin表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），表明人參皂苷Rh4能改善順鉑誘導(dǎo)的腸黏膜損傷。

3.2人參皂苷Rh4對順鉑誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活力的影響

通過構(gòu)建順鉑致IEC-6細(xì)胞損傷模型，從體外角度進(jìn)一步探究人參皂苷Rh4對IEC-6細(xì)胞的保護(hù)作用，根據(jù)文獻(xiàn)報道，順鉑在造模時間為24 h時對細(xì)胞損傷程度最佳[23]。利用MTT法篩選順鉑對IEC-6細(xì)胞損傷的最佳劑量，結(jié)果如圖2-A所示，0.50～32.00 μmol/L順鉑對細(xì)胞活力有不同程度的抑制作用，順鉑為1 μmol/L時細(xì)胞活力達(dá)到75.2%，故選用1 μmol/L順鉑為后續(xù)造模劑量。如圖2-B所示，0.625～20.000 μmol/L人參皂苷Rh4對IEC-6細(xì)胞活力無明顯影響，表明人參皂苷Rh4在該劑量范圍內(nèi)無細(xì)胞毒作用。如圖2-C所示，與順鉑組比較，0.625～20.000 μmol/L人參皂苷Rh4處理IEC-6細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力均顯著升高（P＜0.05、0.01）；如圖2-D所示，10 μmol/L人參皂苷Rh4處理IEC-6細(xì)胞3～24 h后，細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.05、0.01）。故選用2.5、5.0、10.0 μmol/L人參皂苷Rh4用于后續(xù)體外實驗。

3.3人參皂苷Rh4對順鉑致小鼠腸損傷模型氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

通過測定小鼠腸道組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)和血清中炎癥因子水平，進(jìn)一步探究人參皂苷Rh4發(fā)揮腸道保護(hù)活性的分子機(jī)制。如圖3-A～E所示，與對照組比較，順鉑組腸組織中MDA水平顯著升高（P＜0.01），GSH-Px和CAT活性顯著降低（P＜0.01），血清中TNF-α和IL-1β水平顯著升高（P＜0.001）；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4各劑量組MDA水平顯著降低（P＜0.05、0.01），GSH-Px和CAT活性顯著升高（P＜0.05、0.01），血清中TNF-α和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

采用免疫熒光和Hoechest 33258染色研究腸道組織的炎癥損傷程度和腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡程度，結(jié)果如圖3-F、G所示，與對照組比較，順鉑組腸組織細(xì)胞凋亡率和NF-κB陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4各劑量組腸組織細(xì)胞凋亡率和NF-κB陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05、0.01），表明人參皂苷Rh4能有效改善順鉑致腸黏膜損傷的炎癥反應(yīng)。

3.4人參皂苷Rh4對順鉑致小鼠腸損傷模型和IEC-6細(xì)胞損傷模型p21/p53/PGC-1α通路的影響

PGC-1α的表達(dá)與線粒體ROS以及線粒體功能密切相關(guān)。通過Western blotting考察p53/PGC-1α通路在維持線粒體穩(wěn)態(tài)中的作用，如圖4所示，體內(nèi)外實驗結(jié)果一致，與對照組比較，順鉑組p21和p53蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01），PGC-1α和p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4各劑量組p21和p53蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05、0.01），PGC-1α和p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01）。

3.5人參皂苷Rh4對順鉑致小鼠腸損傷模型和IEC-6細(xì)胞損傷模型自噬及線粒體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為深入揭示人參皂苷Rh4改善腸黏膜屏障功能與調(diào)節(jié)線粒體功能之間的關(guān)系，通過Western blotting檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步證明PGC-1α途徑對線粒體自噬通量的重要作用。如圖5所示，與對照組比較，順鉑組小鼠腸組織p-mTOR、p62、p-Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），p-ULK1、Parkin、Atg14、Atg7、Atg5、Atg3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4各劑量組p-mTOR、p62、p-Beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），p-ULK1、Parkin、Atg14、Atg7、Atg5、Atg3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），表明人參皂苷Rh4通過PGC-1α促進(jìn)線粒體自噬通量。

體外實驗結(jié)果如圖6所示，與對照組比較，順鉑組IEC-6細(xì)胞p-mTOR、p62、LC3-I/II蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），p-ULK1、Atg14、Atg7、Atg5、Atg3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01）；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4各劑量組p-mTOR、p62、LC3-I/II蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），p-ULK1、Atg14、Atg7、Atg5、Atg3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），表明順鉑可抑制IEC-6細(xì)胞線粒體自噬，而人參皂苷Rh4預(yù)處理能有效促進(jìn)細(xì)胞的線粒體自噬，進(jìn)一步充分佐證了體內(nèi)實驗結(jié)果。

3.6人參皂苷Rh4對順鉑致IEC-6細(xì)胞損傷模型細(xì)胞凋亡的影響

線粒體細(xì)胞膜電位是評價線粒體正常功能的重要指標(biāo)之一，不僅反映了線粒體功能的完整性，對腸黏膜屏障功能、細(xì)胞凋亡的調(diào)控方面都具有重要作用。此外，線粒體細(xì)胞膜電位變化是細(xì)胞凋亡最早期的變化，亦是影響線粒體ROS產(chǎn)生以及腸黏膜通透性的重要指標(biāo)。為進(jìn)一步探究細(xì)胞凋亡在順鉑致腸黏膜損傷的作用，通過JC-1染色以及流式細(xì)胞術(shù)檢測順鉑誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果見圖7-A、B，與對照組比較，順鉑組線粒體細(xì)胞膜電位顯著降低（P＜0.01），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4各劑量組線粒體細(xì)胞膜電位顯著升高（P＜0.05、0.01），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。通過Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖7-C，與對照組比較，順鉑組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與順鉑組比較，人參皂苷Rh4各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01），Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9和Cyt-C蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05、0.01），表明人參皂苷Rh4能有效改善順鉑誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞凋亡。

4討論

鉑類藥物引發(fā)的胃腸道不良反應(yīng)嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，目前臨床尚無治療順鉑引起的腸道毒性的特異性藥物[5,24-25]。因此，研究者致力于開發(fā)和利用天然藥物來減輕順鉑在治療過程中所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，為患者愈后提供更多可能性。人參皂苷Rh4是紅參中較為重要的一種稀有皂苷，在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、恢復(fù)線粒體功能、抗炎以及抗氧化方面具有顯著的藥理作用[14-15]。據(jù)此，本研究通過免疫熒光染色、線粒體膜電位以及Western blotting等方法，從胃腸道機(jī)械屏障、炎癥反應(yīng)、線粒體自噬和細(xì)胞凋亡等角度闡明人參皂苷Rh4緩解順鉑致腸黏膜損傷的作用機(jī)制。

研究表明，順鉑引起腸黏膜破壞和腸屏障功能減弱，與線粒體功能密切相關(guān)[26]。血液中DAO活性是早期診斷腸黏膜損傷的敏感指標(biāo)[27]，機(jī)體血清中DAO活性可以初步體現(xiàn)腸黏膜的受損程度。此外，腸道機(jī)制屏障還與腸黏膜上皮細(xì)胞上的緊密連接密切相關(guān)，其胞質(zhì)跨膜蛋白與銜接子蛋白之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)是緊密連接蛋白的重要組成部分，主要包括Occludin、claudin-1和ZO-1等蛋白[28]。本研究結(jié)果顯示，小鼠ip順鉑后血清DAO活性顯著升高，腸黏膜嚴(yán)重?fù)p傷，絨毛斷裂，隱窩損傷變形，杯狀細(xì)胞減少，ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)明顯降低；而人參皂苷Rh4預(yù)處理可顯著降低血清中DAO活性，上調(diào)腸組織ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)，表明人參皂苷Rh4可通過促進(jìn)緊密相關(guān)蛋白的表達(dá)，恢復(fù)腸黏膜屏障功能。

此外，線粒體自噬與細(xì)胞凋亡對于維持腸黏膜屏障功能以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[29]。線粒體自噬可選擇性地去除多余和受損的線粒體，并與線粒體生物發(fā)生、線粒體的數(shù)量和質(zhì)量密切相關(guān)[30]。在外界環(huán)境因素的刺激下，細(xì)胞內(nèi)線粒體會出現(xiàn)去極化損傷并導(dǎo)致線粒體膜電位消散，加重線粒體功能障礙，這與許多疾病的發(fā)病機(jī)制均有一定的聯(lián)系[31]。Scott等[32]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的PGC-1α可以激活溶酶體的合成，維持線粒體合成與線粒體自噬的平衡。Palikaras等[33]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK通過PGC-1α維持線粒體生物合成與線粒體自噬之間的能量代謝平衡。以上研究從不同角度證明了PGC-1α在協(xié)同調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生和線粒體自噬中的關(guān)鍵作用。Han等[34]在敲除p21WAF1/CIP1的結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，p21可通過AMPK/PGC-1α途徑增加線粒體生物合成的水平。在本研究中，順鉑能導(dǎo)致線粒體功能受損，線粒體自噬和凋亡水平顯著升高，與先前研究結(jié)果一致。人參皂苷Rh4通過調(diào)節(jié)線粒體PGC-1α途徑，有效抑制了自噬相關(guān)蛋白p21、p53蛋白的表達(dá)，并緩解細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這充分表明人參皂苷Rh4能明顯恢復(fù)線粒體功能，激活PGC-1α途徑，調(diào)控線粒體自噬和細(xì)胞凋亡，改善腸黏膜損傷，進(jìn)一步彰顯了中醫(yī)藥臨床診療的優(yōu)勢，也為人參皂苷Rh4深度開發(fā)奠定基礎(chǔ)。然而，順鉑致腸黏膜損傷的機(jī)制復(fù)雜，本研究尚未闡明PGC-1α通路在順鉑誘導(dǎo)腸道損傷和炎癥性腸病及相關(guān)疾病中的作用的具體關(guān)系，而且人參皂苷Rh4改善線粒體功能是否與線粒體生物發(fā)生有關(guān)還有待進(jìn)一步探究。

綜上，本研究通過闡明人參皂苷Rh4可顯著恢復(fù)腸道內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，改善腸道黏膜屏障功能拮抗順鉑誘導(dǎo)小鼠腸道毒性，其分子機(jī)制可能與激活PGC-1α、促進(jìn)線粒體自噬、抑制細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)。本研究明確了人參皂苷Rh4具有維持線粒體功能的作用，促進(jìn)人參皂苷Rh4在臨床治療順鉑致腸道損傷的應(yīng)用和發(fā)展，為深入探究順鉑誘導(dǎo)腸道損傷的分子機(jī)制提供新的思路，也為揭示人參皂苷Rh4在臨床診治腸黏膜屏障方面的應(yīng)用提供新策略；而且本研究闡述的PGC-1α與線粒體自噬途徑之間的關(guān)系，為臨床探究順鉑不良反應(yīng)的潛在靶點提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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