作者：程松

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導語

本研究成功實現了僅憑一根羽毛即可精準判別鸚鵡性別，為解決鸚鵡人工繁育、瀕危物種保護及進化研究中的性別鑒定瓶頸提供了強有力的技術支撐。

摘要

鸚鵡為單態性鳥, 很難通過外觀和形態來進行性別鑒定，傳統的性別鑒定方法不再適合單態性物種，給人工配對與繁殖造成了困難。本實驗利用非傷害性取樣方法，提取10只已知性別鸚鵡羽毛的基因組DNA，然后通過引物Sex F/Sex R的對其CHD基片段進行擴增，Sex F/Sex R的PCR產物大小分別是650bp與500bp，結果顯示,特異性引物從雄性鸚鵡中擴增出1條片段, 從雌性鸚鵡中擴增出2條片段, 均可以對鸚鵡的性別作出了準確鑒定, 解決了鸚鵡人工繁育中的關鍵問題。

關鍵詞：鸚鵡；性別鑒定；CHD基因

前言

鸚鵡屬于鸚形目（Psittaciformes），有鸚鵡科和鳳頭鸚鵡科2個科、82個屬、358個種，是當今鳥綱中最大的科之一，屬于典型的攀禽，分布在世界各地的熱帶地區。鸚鵡以其靚麗的羽毛以及能夠模仿人類語言等特點，被大多數人欣賞和愛護，因而經常被人們作為寵物飼養，而它們的野生種群也因此受到了威脅， 許多種類都已經成為瀕危物種。鸚鵡是一種單態性鳥，即雌雄同型，它們的性別鑒定很難通過外觀以及其他行為進行判斷區別，這給配對造成了很大的困難。在動物園或鸚鵡養殖場中，如果可以通過鑒定雛鳥的性別，就能淘汰非目的的性別個體，也能降低飼養成本，提高經濟效益，并且在人工飼養管理、有效的繁殖、遺傳研究與疾病防治等方面有重要的意義，尤其是對如今一些瀕危的珍稀鳥類的保護與管理具有重要的意義。

目前，可用于鑒定單態性鳥或雙態性幼鳥性別的傳統方法有：目測性器官；通過組織培養進行染色體分析；測定糞便中雌激素與睪酮比例；對性腺進行直接造影的內窺鏡及超聲波檢查；體尺測量法；用錄音機錄下鳴叫聲比較聲波頻率等；這些方法的性別鑒定，耗體力、可靠性差、且鑒定結果誤差大。鳥類的性染色體為ZW型，ZZ為雄性，ZW為雌性。隨著近年來，分子生物學的高速發展，分子鑒定鳥類的性別的措施也趨于盛行。其實驗過程較于傳統方法更簡便、其實驗結果比傳統方法也更準確、實驗材料的采集也更簡單方便。尤其是對于瀕危野生動物，非損傷采樣法的運用更主流化[1]。分子性別鑒定是目前比較廣泛使用的方法。對于非平胸鳥類，應用最多的是CHD基因，染色體螺旋蛋白基因（chromobox-helicase-DNA binding gene），

CHD基因十分保守，并且有兩個同源拷貝CHD-W和CHD-Z。其中CHD-W是關于W連鎖，

CHD-Z是關于Z連鎖[2-3]。雌性個體中具有兩個同源拷貝 CHD-W和 CHD-Z ，而雄性個體中只有 CHD-Z。故雄性個體（ZZ）只有一個拷貝CHD-Z，只有一個條帶；雌雄個體（ZW）有兩個拷貝 CHD-Z、CHD-W，可顯示出兩個條帶。因此，本研究通過對10只已知性別的鸚鵡進行性別鑒定，旨在探索一種簡便且準確度高的鸚鵡的性別鑒定方法，這對于動物園與鸚鵡繁殖場的人工飼養、保護物種以及繁殖育種等至關重要。

一、材料與試劑

1.1儀器

超凈工作臺（蘇凈集團安泰空氣技術有限公司）、FA1604 型電子分析天平（上海天平儀器廠）、PCR擴增儀（Bio-Rad公司）、高速冷凍離心機（美國Thermo公司）、DY-A型電泳儀（上海康達電子儀器廠）、Hema紫外透射分析儀凝膠成像系統（珠海市黑馬醫學儀器有限公司）、水浴鍋（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）、渦旋震蕩儀（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）、微波爐（佛山順德區美的微波爐電器制造有限公司）、移液槍（德國eppendorf公司）

1.2 試劑

Forensic DNA Kit提取試劑盒、Mix均購自于OMEGA公司，核酸染料GoodView、DNA Marker DL2000、瓊脂糖、50X TAE電泳緩沖液購自Invitrogen公司、無水乙醇購自深圳市東茂化學試劑有限公司

1.3 材料

11只鸚鵡的羽毛由廣州某寵物醫院提供，均已通過繁殖證實性別，編號分別為 HP01、 HP02、HP03、HP04、MD05、MD06、MD07、MD08、XF09與XF10，進行DNA抽提，保存在﹣20℃備用。

二、實驗方法

2.1引物的設計與合成

根據Genbank已公布的CHD的基因組序列，利用分子生物學軟件設計了1對CHD基因的引物，為Sex F/Sex R，Sex F/Sex R目的片段大小為650bp與500bp，引物序列如下：

Sex F：5′- GTTACTGATTCGTCTACGAG -3′；

Sex R：5′- ATTGAAATGATCCAGGCTTG-3′；

引物由廣州睿博興科生物技術有限公司合成。

2.2 鸚鵡羽毛DNA的提取

在10個無菌的2mL的EP管的管壁標記HP01、 HP02、HP03、HP04、MD05、MD06、MD07、MD08、XF09與XF10，然后在每管加入血液50uL，加入200uL Buffer STL，60℃水浴15min，加入25uL蛋白酶K，混勻，加入225uL Buffer BL與225uL無水乙醇，混勻，然后用DNA Wash Buffer洗滌，最后用40uL預熱到70℃的Elution Buffer溶解DNA，DNA保存在﹣20℃備用；具體的步驟參照OMEGA公司的Forensic DNA Kit試劑盒說明書。

2.3 PCR擴增與PCR擴增體系

PCR反應體系：

以羽毛中提取的DNA為模板，以Sex F/Sex R為引物進行PCR反應，反應體系為25ul：2×Trans Taq-TPCRSuperMix 12.5ul、模板DNA 1.0uL、Sex F 1.0uL、Sex R 1.0uL、ddH2O 9.5uL；

反應程序為：

95℃ 4mi n；94℃ 30 s ，44℃ 30 s，72℃ 50s，35個循環；72℃，10 min，PCR反應結束后，將PCR產物放入4℃保存。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

取8uL的PCR擴增產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120V，20min結束后，用Hema紫外透射分析儀凝膠成像系統檢測擴增結果，拍照記錄，使用DNA Marker DL2000進行標記。

三、實驗結果

3.1 CHD基因Sex F/Sex R引物對PCR擴增結果

對10份鸚鵡的羽毛樣品，Sex F/Sex R引物經過PCR擴增之后，再經過電泳結果顯示，雄性個體顯示為一條帶CHD-Z（500bp），雌性個體顯示為兩條帶CHD-Z（500bp）、CHD-W（650bp）。與預期的目的條帶相符(圖1)。

M:2000bp DNA Maker；1-10:鸚鵡CHD基因PCR產物;

圖1 鸚鵡CHD基因的PCR檢測結果

3.2 鸚鵡性別鑒定結果

10只鸚鵡性別鑒定結果統計見表1。

表1 10只鸚鵡性別鑒定結果

四、討論分析

鳥類的基因型為ZW型（ZZ為雄性，ZW為雌性），隨著城市化與工業化的快速發展，以及不法分析的非法捕殺的影響，我們賴以生存的生態環境正在遭受到污染與破壞，導致許多珍稀鳥類正在瀕臨種族滅絕的危險。因此很多動物園模擬鳥類的野外生活環境，讓它們有更好的棲息與繁殖的環境，提高它們的存活率與繁殖率。動物的繁殖與育種，都離不開動物的個體性別的鑒定 [4-5] 。世界上60%鳥類是單態性鳥，即雌性同型，很難在外形上、生理上以及行為上進行性別鑒定，即使對于一些雌雄異性的鳥類進行性別鑒定也很難，只有在性成熟后，雌雄在形態上才有區別，特別是對雛鳥進行性別鑒定就更難了。因此，分子生物學方法便成為鳥類性別鑒定的簡便與有效的方法，早期主要是使用RAPD、熒光標記性染色體基因探針、Southen雜交幾乎可以鑒定所有的鳥類 [6-7] 。

后來發展到用PCR方法擴增性染色連鎖基因的特異性區段序列，CHD基因被Griffiths等 [7] 發現，其進化速率慢，在所有的非平胸鳥類中都非常保守，根據在Z/W染色體上的分布以及序列差異，從而快速簡便對鳥的性別進行鑒定。Griffiths等利用P2/P8引物對雞形目等28個種的鳥進行性別鑒定，其中只有對平胸鳥類中的鴕鳥不能做出正確的鑒定，因此該方法在非平胸目非常適用[8]。江杉等利用引物P2/P8擴增出CHD基因片段，成功鑒別鸛形目5種鷺科鳥類與1種鹮科鳥類 [9] ，袁夢利用2550F/2718R引物擴增出CHD基因片段，對鵜鶘的性別進行鑒定，并進行了常見鳥類的相應同源性序列進行聚類分析。胡銳穎等同樣以2550F/2718R引物，成功的鑒定出了綠孔雀、白鶴、黑頸鶴、白頭鶴、白枕鶴、東方白鶴等國家一級保護鳥類進行性別鑒定 [10] 。

目前在鳥類研究中，主要是采集換羽期的羽毛，從羽毛中提取基因組DNA。 Trefil et al證實了可以利用鳥類羽毛提取DNA。目前主要是從羽毛根部 提取基因組DNA，在拔取羽毛的過程中，該部位可能會帶有部分血液或組織，因此提取物中DNA量較多，不含蛋白質和RNA等物質，在提取過程中不易發生DNA降解情況。另外，田秀華等為解決珍稀瀕危鳥類分子生物學研究中存在的取樣局限性問題，對大鴇羽毛的不同部位的DNA提取進行了研究。研 究發現羽毛羽根部位可以提出一定純度的核DNA和mtDNA，這些研究拓寬了珍稀 瀕危鳥類采樣的范圍，為珍稀瀕危鳥類的分子生物學研究提供了更廣闊的樣品來源。本研究采集鸚鵡換羽期的次級飛羽，從羽根部位提取基因組DNA，結果發現羽根部位提取的一定純度和濃度的DNA，能夠順利進行PCR擴增。

本研究前期利用引物對Sex F/Sex R對已知性別的鸚鵡進行實驗，性別鑒定結果與已只鸚鵡的性別完全一致。目前，鸚鵡性別鑒定的分子生物學方法主要被科研機構和一些專門從事鳥類性別鑒定的商業公司應用，但是隨著鸚鵡育種、瀕危鸚鵡物種保護以及進化研究等方面的工作越來越受到重視，該種方法的應用范圍必將逐漸擴大，并且會產生廣闊的市場前景。希望這種技術將為今后鸚鵡繁殖育種、保護瀕危的物種以及國際交流瀕危鳥類提供可靠的技術資料，對鳥類的人工繁殖、細胞遺傳學以及進化生物學的研究具有重要的意義。

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[1]田秀華，劉鑄，何相寶，等.7種鶴形目鳥類性別的分子鑒定[J].動物學雜志，2006（05）：62-67.

[2]沈瑋，潘少坤，羅紅梅，等.基于CHD基因序列分析的帝企鵝性別鑒定研究[J].安徽農業科學，2010（03）：1167-1168.

[3]李明，丁長春，魏輔文，等.朱鹮性別鑒定相關基因及其性別鑒定[J].科學通報，2001（02）：129-131.

[4]劉鑄，白素英，田秀華.CHD基因與非平胸鳥類性別鑒定[J].生物技術通報，2006（01）：147-150.

[5]LESSELLS C,VTITEMAN A.Sexing birds using random amplified polymorphic DNA(RAPD) markers [J].Molecular Ecology, 1998, 7: 187-195.

[6]OGAWA A, Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing Carinate birds [J]. Chromosome Research, 1997,5: 93-101.

[7]Griffiths R,Tiwari B.Sex of the last wild Spix macaw [J].Nature, 1995, 375(6531): 454.

[8]GRIFFITS R,DOUBLE M C, ORR K.et al.A DNA test to sexmost birds [J].Molecular Ecology, 1998, 7: 1071-1075.

[9]江杉，陳小麟.擴增性別鑒定基因片段的鷺類性別鑒定方法的研究[J].廈門大學學報：自然 科學版，2006,45(S1): 152-155.

[10]胡銳穎，耿昕，馬君.一種簡單通用的鳥類性別分子鑒定技術[J].實驗生物學報，2003,36(5): 401-404.

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編 輯|張秋雁

審 核|郭羽麗