一、 簡介

膽汁酸（BAs）是一類以甾體為母核側(cè)鏈的、含有羥基的重要內(nèi)源代謝物[1]。不僅僅作為人體內(nèi)膽固醇代謝的終產(chǎn)物，膽汁酸以信號分子的身份在信號傳導(dǎo)、代謝調(diào)控等方面發(fā)揮著重要的功能。本文將介紹人體中經(jīng)典的膽汁酸相互作用蛋白及其功能，并對新型膽汁酸受體的發(fā)現(xiàn)策略及當(dāng)前進展進行總結(jié)。

二、 膽汁酸介紹

膽汁酸（BAs）是一類分子的總稱，其中包含由肝臟細胞合成的初級膽酸和由腸道共生菌進一步代謝產(chǎn)生的次級膽酸。初級膽酸的合成由膽固醇起始，在經(jīng)典途徑中膽固醇首先在7α羥化酶（CYP7A1）的催化下生成7α羥基膽固醇，而后在進一步的催化作用下生成膽酸（CA）和鵝去氧膽酸（CDCA）。初級膽酸會進一步地綴合甘氨酸或牛磺酸生成膽鹽儲存在膽囊中。此外，在嚙齒類動物和熊體內(nèi)，CDCA還會分別被進一步轉(zhuǎn)化為鼠膽酸（MCA）和 去氧膽酸（UDCA）[2]。

在進食時，BAs會被釋放到腸道中以輔助對于食物中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并在腸道菌群的作用下進一步地被代謝為次級膽酸。腸道菌群的代謝進一步提升了膽酸池的多樣性，它們首先會通過膽鹽水解酶（BSH）的作用將膽鹽重新轉(zhuǎn)化為CA和CDCA，而后進一步通過脫羥基化作用合成去氧膽酸（DCA）和石膽酸（LCA）。在近些年的研究中，這一脫羥基化過程被證明主要是由Clostridium scindens中bai基因編碼的一系列酶所介導(dǎo)的[3]。在到達回腸末端之前，大約有95%的膽汁酸都會通過肝腸循環(huán)被重吸收，僅有少量會隨糞便排出體外。

圖1：膽汁酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)及人體內(nèi)膽汁酸的肝腸循環(huán)[4]

三、 經(jīng)典膽汁酸相互作用蛋白

在人體中，目前主要的膽汁酸受體主要包含核受體和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）兩類。其中，核受體主要包括法尼醇X受體（FXR）、孕烷X受體（PXR）、維生素D受體（VDR），主要參與脂質(zhì)與葡萄糖穩(wěn)態(tài)、能量代謝、膽汁酸本身的合成方面的調(diào)控[5]。GPCR類受體則主要包括G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1（GPBAR1或TGR5）、鞘氨醇-1-磷酸受體（S1PR2）和毒蕈堿型乙酰膽堿受體（CHRM2/3），參與抗炎及免疫調(diào)節(jié)[6, 7]。

• FXR調(diào)控膽汁酸的合成與轉(zhuǎn)運

FXR是首個被發(fā)現(xiàn)的膽汁酸受體，其可以被游離型和結(jié)合型膽酸所激活[8]。激活后的FXR通常會通過兩種方式調(diào)控下游基因的表達：①與維甲酸X受體（RXR）形成異源二聚體促進目標(biāo)基因的表達；②上調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制子小異二聚體伴侶（SHP），SHP競爭性地與其他核受體結(jié)合從而抑制基因的表達。

在腸道細胞中，BAs激活成纖維細胞生長因子 15 (FGF15)/FGF19，該因子會進入肝臟，通過 FGF 受體 (FGFR) 抑制 BAs代謝。BAs也可以直接激活肝臟中的FXR，促進SHP表達。而這兩條信號通路也均能抑制CYP7A1和CYP8B1的表達，從而抑制BAs的合成[9]。此外，為降低BAs對細胞的毒性，F(xiàn)XR一方面促進BA-CoA合成酶BAAT的表達，從而降低疏水性更強的游離膽酸含量[10]。另一方面，F(xiàn)XR也會通過促進微管膽鹽外排泵（BSEP）的表達以及抑制BAs轉(zhuǎn)運蛋白，如有機陰離子轉(zhuǎn)運肽1（OATP1），來降低BAs在細胞中的積累[11]。

與FXR相似，PXR和VDR也在BAs的轉(zhuǎn)運與清除中發(fā)揮著重要的作用。PXR和VDR被激活后會通過促進CYP3A和磺基轉(zhuǎn)移酶（SULTs）的表達，使疏水性最強的膽汁酸LCA氧化或者形成磺酸鹽[12, 13]。此外，二者也會通過促進LCA外排蛋白OATP2和多藥耐藥蛋白3（MRP3）的表達，起到減毒的作用[14, 15]。

圖2：膽汁酸的信號傳導(dǎo)[16]

• TGR5參與能量及免疫調(diào)節(jié)

TGR5是首個被鑒定為能被BAs激活的GPCR[7]，其廣泛存在于棕色脂肪細胞、巨噬細胞、單核細胞、脾臟細胞、膽囊上皮細胞和腸道中，且發(fā)揮著不同的功能，尤其在結(jié)腸中有較高的表達水平[8]。在腸道巨噬細胞中，TGR5被激活后影響TNFα和NF-κB通路，抑制促炎細胞因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎的作用[17]。在棕色脂肪細胞中， TGR5 通過誘導(dǎo) 2 型碘甲狀腺氨酸-脫碘酶的表達來刺激能量消耗，從而將無活性的甲狀腺素轉(zhuǎn)化為 3,5,3'-三碘甲狀腺氨酸，從而激活甲狀腺激素受體，激活線粒體功能并增加產(chǎn)熱，以及激活線粒體生物發(fā)生的調(diào)節(jié)劑[18]。

受體

配體激活效力

FXR

CDCA＞LCA=DCA＞CA

PXR

3-keto-LCA＞LCA＞DCA=CA

VDR

LCA＞DCA＞CA

TGR5

LCA≥DCA＞CDCA＞CA

表1：不同膽汁酸對受體的激活能力

四、 化學(xué)探針在膽汁酸相互作用蛋白發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

盡管關(guān)于膽汁酸的受體及其所介導(dǎo)的信號通路方面的研究已經(jīng)取得了一系列重要的進展，但這些研究仍然主要集中在FXR和TGR5這兩個最早被發(fā)現(xiàn)的BAs受體上。因此，新型的膽汁酸受體亟待被發(fā)現(xiàn)和研究。化學(xué)小分子探針的開發(fā)對于這些BAs相互作用蛋白的鑒定及研究發(fā)揮著重要的作用。近些年來，研究者在膽汁酸分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進行衍生，發(fā)展了一系列探針，并聯(lián)合化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)實現(xiàn)了新型膽汁酸受體的發(fā)現(xiàn)與研究。

• BAs探針的設(shè)計

基于此前的研究，BAs與受體蛋白的相互作用一般是非共價的。因此，為實現(xiàn)小分子與蛋白的穩(wěn)定結(jié)合，可以在不影響其本身活性的基礎(chǔ)上，在其結(jié)構(gòu)上引入光交聯(lián)基團。目前，常見的光交聯(lián)基團包括二苯甲酮、雙吖丙啶等[19]。以雙吖丙啶為例，在UV365nm波長的照射下，該基團會產(chǎn)生卡賓自由基并隨機地插入到鄰近的氨基酸殘基中，從而將小分子探針和與之鄰近的蛋白穩(wěn)定連接。實現(xiàn)穩(wěn)定連接后，BAs探針同時需要一個可富集基團用于對靶蛋白的鑒定。而一價銅離子催化的炔基-疊氮環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC or Click Chemistry）[20]則因反應(yīng)條件溫和、生物相容性好等優(yōu)勢，廣泛地被引入到探針的設(shè)計中。

圖3：常見光交聯(lián)基團及探針設(shè)計[19]

• 宿主細胞中BAs相互作用蛋白的發(fā)現(xiàn)

受到Hulce等所開發(fā)的膽固醇光交聯(lián)探針啟發(fā)[21]，Zhuang等在人體內(nèi)含量最高的初級膽酸CA的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)展了一系列的光交聯(lián)探針。作者在CA分子結(jié)構(gòu)的不同位置進行改造，，作者發(fā)現(xiàn)P2交聯(lián)到681個靶蛋白，在三種探針中數(shù)目最多，且能夠鑒定到FXR、EPHX1等已知的CA受體。詳細內(nèi)容見【號外 | 王初課題組利用光交聯(lián)探針大規(guī)模鑒定膽酸相互作用蛋白】。

• 腸道共生菌中BAs相互作用蛋白的發(fā)現(xiàn)

人體內(nèi)的腸道共生菌也長期處于膽汁酸的環(huán)境中。為探究細菌如何耐受高濃度的膽汁酸，Liu等進一步采用CA光交聯(lián)探針探究了CA在大腸桿菌（Escherichia coli，strain K12）中的相互作用蛋白[23]。采用定量化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，作者在細菌裂解液中鑒定到587個置信度較高的CA相互作用蛋白，并通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要集中在具有自磷酸化功能的雙組份系統(tǒng)（Two-component Systems，TCS）中。在進一步研究中，作者發(fā)現(xiàn)細菌內(nèi)膜蛋白EnvZ作為一個新型的CA受體在細菌感受膽酸壓力中起到重要的作用。當(dāng)CA與EnvZ的周質(zhì)區(qū)結(jié)合后，會促進下游反應(yīng)調(diào)節(jié)子OmpR的磷酸化，最終促進外膜孔道蛋白OmpC的表達，從而加速CA外排，以實現(xiàn)對于膽汁酸的耐受。詳細內(nèi)容見【號外 |王初課題組與雷曉光課題組合作發(fā)展化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略揭示細菌耐受膽汁酸的機制】。

圖4：EnvZ作為CA受體促進膽汁酸耐受

• 病原菌中的BAs相互作用蛋白發(fā)現(xiàn)

為探究膽汁酸抵抗病原菌入侵的分子機制。美國Scripps研究所的Howard C. Hang教授及合作者針對CDCA以及次級膽汁酸LCA發(fā)展了光交聯(lián)探針并評價了這些探針的生物學(xué)活性。在沙門氏菌入侵宿主細胞的體系中，Yang等[24]發(fā)現(xiàn)與其他幾種常見的膽汁酸相比，只有CDCA表現(xiàn)出顯著的抵抗沙門入侵HT-29細胞的能力，且在其C3位衍生光交聯(lián)基團和用于富集的炔基基團不影響其抗菌活性。因此他們采用alk-X-CDCA探針用于沙門中的CDCA相互作用蛋白發(fā)現(xiàn)并以UDCA和LCA探針作為對照，采用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)策略鑒定那些被CDCA探針特異性富集到的靶點。最終，他們發(fā)現(xiàn)CDCA可以通過與毒力相關(guān)蛋白HilD的Jelly-roll結(jié)構(gòu)域結(jié)合、干擾其二聚從而發(fā)揮降低細菌毒力的功能。詳細內(nèi)容見【Nat. Chem. Biol.｜膽酸可結(jié)合沙門氏菌毒性調(diào)節(jié)因子并發(fā)揮抗感染效果】。

圖5：CDCA抑制沙門氏菌中的毒力調(diào)節(jié)因子

此外，為探究LCA在抵抗艱難梭菌感染（C. difficile infections，CDI）中的作用，F(xiàn)orster等[25]采用alk-X-LCA鑒定了艱難梭菌中的石膽酸互作蛋白。該探針在C3-OH基礎(chǔ)上通過醚鍵衍生炔基，并在C7位衍生雙吖丙啶基團。通過評價探針對艱難梭菌的抑菌活性，作者發(fā)現(xiàn)alk-X-LCA具有比天然LCA更好的抑菌效果。通過組學(xué)研究，作者發(fā)現(xiàn)LCA可以與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子BapR相互作用并促進甲硫氨酸γ裂解酶MdeA以及兩種推定的轉(zhuǎn)運體的表達，從而促進艱難梭菌的代謝適應(yīng)。

圖6：LCA結(jié)合艱難梭菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子

五、 總結(jié)

膽汁酸受體的發(fā)現(xiàn)加深了人們對膽汁酸信號傳導(dǎo)的認(rèn)識，同時也推動了新型疾病療法的開發(fā)。針對當(dāng)前研究較為深入的膽汁酸受體FXR和TGR5，研究人員開發(fā)了相應(yīng)的激動劑和拮抗劑并用于了膽汁淤積、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、非酒精性脂肪肝炎（NASH）及糖尿病等疾病的治療。近些年來，化學(xué)蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展推動了新型膽汁酸受體的發(fā)現(xiàn)，且隨著人們對腸道菌群研究的不斷深入，腸道共生菌及病原菌中的膽汁酸受體也得到了廣泛的關(guān)注和研究，而這些研究將為肝臟及腸道疾病的治療提供新的思路。