一、 簡介

膽汁酸（BAs）是一類以甾體為母核側鏈的、含有羥基的重要內源代謝物[1]。不僅僅作為人體內膽固醇代謝的終產物，膽汁酸以信號分子的身份在信號傳導、代謝調控等方面發揮著重要的功能。本文將介紹人體中經典的膽汁酸相互作用蛋白及其功能，并對新型膽汁酸受體的發現策略及當前進展進行總結。

二、 膽汁酸介紹

膽汁酸（BAs）是一類分子的總稱，其中包含由肝臟細胞合成的初級膽酸和由腸道共生菌進一步代謝產生的次級膽酸。初級膽酸的合成由膽固醇起始，在經典途徑中膽固醇首先在7α羥化酶（CYP7A1）的催化下生成7α羥基膽固醇，而后在進一步的催化作用下生成膽酸（CA）和鵝去氧膽酸（CDCA）。初級膽酸會進一步地綴合甘氨酸或牛磺酸生成膽鹽儲存在膽囊中。此外，在嚙齒類動物和熊體內，CDCA還會分別被進一步轉化為鼠膽酸（MCA）和 去氧膽酸（UDCA）[2]。

在進食時，BAs會被釋放到腸道中以輔助對于食物中營養物質的吸收，并在腸道菌群的作用下進一步地被代謝為次級膽酸。腸道菌群的代謝進一步提升了膽酸池的多樣性，它們首先會通過膽鹽水解酶（BSH）的作用將膽鹽重新轉化為CA和CDCA，而后進一步通過脫羥基化作用合成去氧膽酸（DCA）和石膽酸（LCA）。在近些年的研究中，這一脫羥基化過程被證明主要是由Clostridium scindens中bai基因編碼的一系列酶所介導的[3]。在到達回腸末端之前，大約有95%的膽汁酸都會通過肝腸循環被重吸收，僅有少量會隨糞便排出體外。

圖1：膽汁酸的化學結構及人體內膽汁酸的肝腸循環[4]

三、 經典膽汁酸相互作用蛋白

在人體中，目前主要的膽汁酸受體主要包含核受體和G蛋白偶聯受體（GPCR）兩類。其中，核受體主要包括法尼醇X受體（FXR）、孕烷X受體（PXR）、維生素D受體（VDR），主要參與脂質與葡萄糖穩態、能量代謝、膽汁酸本身的合成方面的調控[5]。GPCR類受體則主要包括G蛋白偶聯膽汁酸受體1（GPBAR1或TGR5）、鞘氨醇-1-磷酸受體（S1PR2）和毒蕈堿型乙酰膽堿受體（CHRM2/3），參與抗炎及免疫調節[6, 7]。

• FXR調控膽汁酸的合成與轉運

FXR是首個被發現的膽汁酸受體，其可以被游離型和結合型膽酸所激活[8]。激活后的FXR通常會通過兩種方式調控下游基因的表達：①與維甲酸X受體（RXR）形成異源二聚體促進目標基因的表達；②上調轉錄抑制子小異二聚體伴侶（SHP），SHP競爭性地與其他核受體結合從而抑制基因的表達。

在腸道細胞中，BAs激活成纖維細胞生長因子 15 (FGF15)/FGF19，該因子會進入肝臟，通過 FGF 受體 (FGFR) 抑制 BAs代謝。BAs也可以直接激活肝臟中的FXR，促進SHP表達。而這兩條信號通路也均能抑制CYP7A1和CYP8B1的表達，從而抑制BAs的合成[9]。此外，為降低BAs對細胞的毒性，FXR一方面促進BA-CoA合成酶BAAT的表達，從而降低疏水性更強的游離膽酸含量[10]。另一方面，FXR也會通過促進微管膽鹽外排泵（BSEP）的表達以及抑制BAs轉運蛋白，如有機陰離子轉運肽1（OATP1），來降低BAs在細胞中的積累[11]。

與FXR相似，PXR和VDR也在BAs的轉運與清除中發揮著重要的作用。PXR和VDR被激活后會通過促進CYP3A和磺基轉移酶（SULTs）的表達，使疏水性最強的膽汁酸LCA氧化或者形成磺酸鹽[12, 13]。此外，二者也會通過促進LCA外排蛋白OATP2和多藥耐藥蛋白3（MRP3）的表達，起到減毒的作用[14, 15]。

圖2：膽汁酸的信號傳導[16]

• TGR5參與能量及免疫調節

TGR5是首個被鑒定為能被BAs激活的GPCR[7]，其廣泛存在于棕色脂肪細胞、巨噬細胞、單核細胞、脾臟細胞、膽囊上皮細胞和腸道中，且發揮著不同的功能，尤其在結腸中有較高的表達水平[8]。在腸道巨噬細胞中，TGR5被激活后影響TNFα和NF-κB通路，抑制促炎細胞因子的釋放，從而發揮抗炎的作用[17]。在棕色脂肪細胞中， TGR5 通過誘導 2 型碘甲狀腺氨酸-脫碘酶的表達來刺激能量消耗，從而將無活性的甲狀腺素轉化為 3,5,3'-三碘甲狀腺氨酸，從而激活甲狀腺激素受體，激活線粒體功能并增加產熱，以及激活線粒體生物發生的調節劑[18]。

受體

配體激活效力

FXR

CDCA＞LCA=DCA＞CA

PXR

3-keto-LCA＞LCA＞DCA=CA

VDR

LCA＞DCA＞CA

TGR5

LCA≥DCA＞CDCA＞CA

表1：不同膽汁酸對受體的激活能力

四、 化學探針在膽汁酸相互作用蛋白發現中的應用

盡管關于膽汁酸的受體及其所介導的信號通路方面的研究已經取得了一系列重要的進展，但這些研究仍然主要集中在FXR和TGR5這兩個最早被發現的BAs受體上。因此，新型的膽汁酸受體亟待被發現和研究。化學小分子探針的開發對于這些BAs相互作用蛋白的鑒定及研究發揮著重要的作用。近些年來，研究者在膽汁酸分子結構基礎上進行衍生，發展了一系列探針，并聯合化學蛋白組學技術實現了新型膽汁酸受體的發現與研究。

• BAs探針的設計

基于此前的研究，BAs與受體蛋白的相互作用一般是非共價的。因此，為實現小分子與蛋白的穩定結合，可以在不影響其本身活性的基礎上，在其結構上引入光交聯基團。目前，常見的光交聯基團包括二苯甲酮、雙吖丙啶等[19]。以雙吖丙啶為例，在UV365nm波長的照射下，該基團會產生卡賓自由基并隨機地插入到鄰近的氨基酸殘基中，從而將小分子探針和與之鄰近的蛋白穩定連接。實現穩定連接后，BAs探針同時需要一個可富集基團用于對靶蛋白的鑒定。而一價銅離子催化的炔基-疊氮環加成反應（CuAAC or Click Chemistry）[20]則因反應條件溫和、生物相容性好等優勢，廣泛地被引入到探針的設計中。

圖3：常見光交聯基團及探針設計[19]

• 宿主細胞中BAs相互作用蛋白的發現

受到Hulce等所開發的膽固醇光交聯探針啟發[21]，Zhuang等在人體內含量最高的初級膽酸CA的結構基礎上發展了一系列的光交聯探針。作者在CA分子結構的不同位置進行改造，，作者發現P2交聯到681個靶蛋白，在三種探針中數目最多，且能夠鑒定到FXR、EPHX1等已知的CA受體。詳細內容見【號外 | 王初課題組利用光交聯探針大規模鑒定膽酸相互作用蛋白】。

• 腸道共生菌中BAs相互作用蛋白的發現

人體內的腸道共生菌也長期處于膽汁酸的環境中。為探究細菌如何耐受高濃度的膽汁酸，Liu等進一步采用CA光交聯探針探究了CA在大腸桿菌（Escherichia coli，strain K12）中的相互作用蛋白[23]。采用定量化學蛋白質組學技術，作者在細菌裂解液中鑒定到587個置信度較高的CA相互作用蛋白，并通過生物信息學分析發現這些蛋白主要集中在具有自磷酸化功能的雙組份系統（Two-component Systems，TCS）中。在進一步研究中，作者發現細菌內膜蛋白EnvZ作為一個新型的CA受體在細菌感受膽酸壓力中起到重要的作用。當CA與EnvZ的周質區結合后，會促進下游反應調節子OmpR的磷酸化，最終促進外膜孔道蛋白OmpC的表達，從而加速CA外排，以實現對于膽汁酸的耐受。詳細內容見【號外 |王初課題組與雷曉光課題組合作發展化學蛋白質組學策略揭示細菌耐受膽汁酸的機制】。

圖4：EnvZ作為CA受體促進膽汁酸耐受

• 病原菌中的BAs相互作用蛋白發現

為探究膽汁酸抵抗病原菌入侵的分子機制。美國Scripps研究所的Howard C. Hang教授及合作者針對CDCA以及次級膽汁酸LCA發展了光交聯探針并評價了這些探針的生物學活性。在沙門氏菌入侵宿主細胞的體系中，Yang等[24]發現與其他幾種常見的膽汁酸相比，只有CDCA表現出顯著的抵抗沙門入侵HT-29細胞的能力，且在其C3位衍生光交聯基團和用于富集的炔基基團不影響其抗菌活性。因此他們采用alk-X-CDCA探針用于沙門中的CDCA相互作用蛋白發現并以UDCA和LCA探針作為對照，采用化學蛋白質組學策略鑒定那些被CDCA探針特異性富集到的靶點。最終，他們發現CDCA可以通過與毒力相關蛋白HilD的Jelly-roll結構域結合、干擾其二聚從而發揮降低細菌毒力的功能。詳細內容見【Nat. Chem. Biol.｜膽酸可結合沙門氏菌毒性調節因子并發揮抗感染效果】。

圖5：CDCA抑制沙門氏菌中的毒力調節因子

此外，為探究LCA在抵抗艱難梭菌感染（C. difficile infections，CDI）中的作用，Forster等[25]采用alk-X-LCA鑒定了艱難梭菌中的石膽酸互作蛋白。該探針在C3-OH基礎上通過醚鍵衍生炔基，并在C7位衍生雙吖丙啶基團。通過評價探針對艱難梭菌的抑菌活性，作者發現alk-X-LCA具有比天然LCA更好的抑菌效果。通過組學研究，作者發現LCA可以與轉錄調節因子BapR相互作用并促進甲硫氨酸γ裂解酶MdeA以及兩種推定的轉運體的表達，從而促進艱難梭菌的代謝適應。

圖6：LCA結合艱難梭菌中的轉錄調節因子

五、 總結

膽汁酸受體的發現加深了人們對膽汁酸信號傳導的認識，同時也推動了新型疾病療法的開發。針對當前研究較為深入的膽汁酸受體FXR和TGR5，研究人員開發了相應的激動劑和拮抗劑并用于了膽汁淤積、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、非酒精性脂肪肝炎（NASH）及糖尿病等疾病的治療。近些年來，化學蛋白組學技術的發展推動了新型膽汁酸受體的發現，且隨著人們對腸道菌群研究的不斷深入，腸道共生菌及病原菌中的膽汁酸受體也得到了廣泛的關注和研究，而這些研究將為肝臟及腸道疾病的治療提供新的思路。