神經回路重建對腦損傷后的修復至關重要。傳統腦機接口BCI通過連接大腦與外部控制器來彌補腦喪失的功能，但在大面積空腔損傷時效果有限。大腦類器官是體外培養的三維神經組織，能夠模擬神經發育與神經回路，并在宿主大腦中表現出良好的存活與軸突生長。將類器官移植到損傷區可能克服傳統BCI的局限性。

近期，天津大學李曉紅團隊結合BCI與類器官移植，開發了類器官-腦機接口（OBCI）系統。研究評估了OBCI的長期安全性和可行性，并探討了神經調控策略。該系統通過調控刺激促進移植物分化與成熟，增強類器官與宿主大腦的連接，展現了修復大腦功能的潛力，未來可指導神經元發育并恢復功能性神經網絡。相關成果于2024年11月6日發表于《Nature Communication》期刊。

結果

OBCI模擬---體外類器官-電極復合體的創建

為模擬類器官-腦機接口（OBCI），研究人員在體外構建了類器官-電極復合體。類器官在體外培養90天后，插入雙支柔性電極（圖1A, B）。在第120天（D120），類器官中觀察到豐富的NeuN+細胞、皮層VI層（TBR1）、V層（CTIP2）、III層（SATB2），以及大腦皮層標志物的表達。還發現星形膠質細胞（GFAP）和谷氨能神經元（VGLUT1標記）。

此外，在D120時類器官組織內形成了豐富的突觸。而且從D90到D150，尖峰放電、爆發活動以及持續時間顯著增加。這表明體外類器官電生理功能的逐漸成熟。

Fig1. 類器官-電極復合體刺激參數探索。A: 類器官-電極復合體示意圖; B: 調節、固定和記錄的時間軸; C: 尖峰發射率與刺激頻率和振幅相關; D,E: 刺激改變尖峰間期分布; F,G: ES組SATB2、CTIP2和TBR1標志物表達更明顯; H,I: ES組SYN+和PSD95+共標點更多，突觸形成更豐富; J, K: GLUT1和MAP2染色顯示ES組突觸增強; L, M: GFAP和NeuN染色表明ES組膠質細胞活性更高; N,O,P,Q: ES組發射率和同步指數顯著高于Ctrl組.

神經調控策略的探索---針對體外類腦器官

為了研究有效的神經調控刺激參數，研究人員在三個電極位置上測試了6個頻率梯度（1,10,30,50,70,100 Hz）和4個振幅梯度（10,30,50,70 μA）。結果顯示，當采用50 Hz頻率和50 μA振幅的恒定電流、陰極引導、雙相方波刺激時，類器官表現出更高的放電頻率（圖1C）。與對照組（未受刺激的類器官）相比，電刺激組（ES組）類器官的峰間間隔（ISI）顯著縮短（圖1D,E）。

電刺激還促進了類器官內皮層板分層結構的變化。ES組在TBR1表達上較對照組減少，CTIP2的比例增加，而SATB2的表達則無顯著差異（圖1G）。重要的是，ES組的突觸密度更高（圖1H,I），VGLUT1的表達水平較高（圖1J,K），星形膠質細胞的數量較對照組有所減少（圖1L,M）。電生理特性分析進一步表明，ES組的尖峰放電率、網絡同步性和低頻能量均高于對照組。上述結果表明，電刺激有效促進了類器官功能的成熟（圖1N-R）。

OBCI的構建與長期有效性

為模擬皮層損傷，研究人員在宿主的初級感覺皮層（S1）創建了損傷空腔。研究團隊將培養40天的GFP+類器官移植至宿主的S1區域(0dpt)，并在移植后第25(25dpt)天進行二次開顱手術，植入雙支柔性電極以進行信號記錄和電刺激，從而構建了OBCI系統（圖2A-C）。

在術后第60天和第120天對電極周圍進行免疫染色（圖2C,D），來評估OBCI對體內組織的安全性。結果表明，電極周圍未見小膠質細胞（IBA1+）或星形膠質細胞（GFAP+）聚集且大部分小膠質細胞未被激活（圖2C,D）。電極周圍的血管結構分布良好，神經元表現出豐富的突觸素表達（圖2D）。在移植物內，神經元逐漸分化（DCX）并逐步成熟（MAP2）（圖2E-G）。總體而言，植入電極未對類器官或宿主大腦造成任何顯著損傷。長期監測結果表明，信號活動隨時間逐漸增強，表明腦類器官正在成熟，且電極持續有效（圖2I,J）。

Fig2.體內構建OBCI。 A: 體內OBCI示意圖; B: 移植物與小鼠大腦的明場顯微照片（有/無電極）; C: 60 dpt 時 OBCI 概覽; D: 60 dpt 時小鼠大腦電極插入情況; E: 120 dpt 時人類細胞核（HN，紅色）和 CD31（綠色）的標記; F-H: 120 dpt 時移植物中 MAP2（F）、DCX（G）和突觸（H）的免疫染色; I: 體內類器官的高通電生理軌跡; J: 電極的頻譜圖; K: 計算 BO、BO-ET 和 BO-ET-ES 組移植小鼠的存活率; L: 柔性電極的信噪比分析.

//**注**//

BO組：類器官植入組

BO-ET組：類器官和電極植入無調節組

BO-ET-ES組：類器官和電極植入后電刺激組

早期刺激通過OBCI促進神經發育

隨后，研究人員在30 dpt和60 dpt兩個關鍵時間點對移植物進行調控，并實施10天體內調控（圖3A）。結果發現BO-ET-ES組相對于其它組表現出更好的移植物生長、分化和功能成熟。具體而言：

（1）移植物增大：60 dpt刺激后，BO-ET-ES組移植物體積顯著增大（圖 3B,C），且Ki67+細胞比例高于BO組和BO-ET組，表明細胞增殖增強（圖3D,E）。

（2）血管浸潤增強：BO-ET-ES組移植物內血管浸潤更多，呈管狀形態（圖3F,G）。

（3）神經分化加速：與BO和BO-ET組相比，BO-ET-ES組移植物中神經祖細胞（PAX6+）減少，成熟神經元（NeuN+）增加（圖3H-K）。

（4）皮質神經元亞型增加：BO-ET-ES組移植物內SATB2+和CTIP2+皮質神經元數量顯著增多（圖 3L-O）。

（5）突觸連接性增強：BO-ET-ES組中hSYN與PSD95共定位點顯著增加，表明突觸連接更為成熟。

Fig3. 早期刺激通過 OBCI 促進類器官移植物分化。A: 類器官植入（0 dpt）、電極插入、1 M刺激和信號記錄的時間表; B: BO、BO-ET和BO-ET-ES組小鼠大腦的類器官生長情況; C: 類器官體積定量分析, BO-ET-ES組顯著增大; D: 60 dpt時，各組免疫熒光染色; E: 定量Ki67+細胞; F: 60 dpt時各組的HN和CD31免疫熒光染色; G: 血管結構（CD31），BO-ET-ES組的血管浸潤更多; H-J: PAX6（神經祖細胞標記）和NeuN（成熟神經元標記）免疫染色; I-K: 定量分析PAX6+和NeuN+細胞; L-N: 120 dpt時CTIP2和SATB2的免疫熒光染色; M-O: 定量CTIP2+HN+細胞和SATB2+/GFP+細胞; P: 180 dpt時三組的hSYN和PSD95共定位的免疫熒光染色; Q: hSYN/PSD95共定位點的數量.

早期刺激通OBCI促進了移植體的功能成熟

在類器官逐步成熟后，研究人員使用OBCI評估了移植體的功能變化（圖4A,B）。結果發現，在為期10天的刺激過程中，BO-ET-ES組的放電頻率顯著高于BO-ET組（圖4C）。局部場電位（LFP）分析顯示，BO-ET-ES組中頻和高頻帶能量顯著增加，而低頻帶能量和信息熵保持穩定（圖4D）。伽馬頻帶能量在BO-ET-ES組顯著增強（圖4K-M）。

重要的是，跨頻率相位-幅度耦合（PAC）分析顯示，BO-ET-ES組的PAC顯著增強，表明移植體功能成熟度提高（圖4N,O）。75dpt時，BO和BO-ET-ES組與未處理小鼠在新物體識別和運動能力測試上無顯著差異，表明電刺激不會損害記憶或運動功能。

Fig4. 早期刺激可通過 OBCIs 促進器官組織的功能成熟。A: 早期刺激的時間軸; B: 行為測試圖像; C: 一天內受刺激有機體電生理學變化; D: 伽馬波段能量分析; E-F: 120 dpt時的高通軌跡（3秒記錄）和光柵圖（60秒記錄）; G-J: 40-180 dpt刺激后的電生理特征; K-L: 120 dpt時功率譜密度和頻譜圖; M: 40-180 dpt伽馬總功率百分比; N-O: Theta-Gamma相位-幅度耦合（PAC）分析; P-Q. von Frey試驗結果.

晚期刺激通過OBCI改善了移植體的結構整合

類器官在60 dpt時廣泛與宿主大腦連接，在此基礎上研究人員評估了晚期刺激對結構整合的影響。結果發現，在120 dpt時，BO、BO-ET和BO-ET-ES組移植體均良好存活（圖5C）。類器官移植體在60、120和150 dpt時逐步向宿主大腦投射，形成模糊邊界的束狀投射（圖5D）。

此外，晚期70Hz刺激顯著增加類器官向同側宿主投射的數量和投射距離（圖5E）。類器官與宿主之間形成興奮性和抑制性突觸連接（圖5F-I）。同時，神經突觸的成熟與密度增強，具體表現在，BO-ET-ES組移植體的神經元突觸棘密度顯著高于BO和BO-ET組（圖5J,K）。

重要的是，類器官向宿主投射的功能性突觸逐步形成，晚期刺激顯著促進突觸整合（圖5M）。以上結果表明，晚期70 Hz刺激通過增強類器官與宿主間的神經投射、突觸形成及功能整合，進一步促進了移植物與宿主大腦的連接性和功能性成熟。

Fig5. 晚期刺激通過OBCI改善了移植體的結構整合。 A: 晚期刺激（60 dpt開始）時間軸及參數; B: 移植物-宿主和宿主-移植物間的突觸結構示意圖; C: 不同組別小鼠在 120 dpt 時的大腦冠狀切片; D:冠狀切片高倍視野顯示移植物的高密度GFP+神經投射; E: 120 dpt 時,投射量化分析; F-H: 120 dpt時移植物內興奮性標記及抑制性標記的免疫染色; G-I: VGLUT1 和 GAD65/67 密度定量; J-K: 120 dpt 時的樹突分支和突棘密度; L-M: 共定位點數量的量化.

晚期刺激通過OBCI改善了神經功能

最后，研究探討了移植體與宿主大腦的電生理功能（圖6A）。結果發現：在為期10天的刺激過程中，類器官的放電頻率、爆發頻率和爆發持續時間顯著增加（圖6B-D），表明移植體內突觸成熟和電信號傳遞的提升。尖峰幅度未見顯著變化（圖6E），表明個體神經元的動作電位保持穩定。

重要的是，電刺激使得類器官與宿主間的連接性和耦合性增強。刺激后，類器官內部的自相關性和類器官與宿主之間的交叉相關性顯著增加（圖6H-J）。刺激后10天至三個月，寬帶低頻和伽馬活動之間的相位-振幅耦合（PAC）持續增強（圖6K），表明電刺激對神經網絡連接的長期促進作用。von Frey機械測試發現移植體整合進宿主S1皮層功能回路，且電刺激促進了晚期行為功能恢復（圖6L-N）。

Fig6. 晚期刺激通過 OBCIs 促進了器官組織與宿主之間的功能整合。A: 2 M 刺激的時間軸; B-E: 刺激后移植體不同時間段的尖峰定量; F-G: 刺激后移植體伽馬頻段能量與功率譜; H-I: 從第 60 天開始，每月為間隔的刺激后移植體內部及移植體-宿主之間的相關性; J: BO-ET-ES 組在 60、90、120 和 150 dpt 的相關系數分布; K: BO-ET-ES 組在 60、90、120 和 150 dpt 時 PAC 分布; L-N: 120 dpt和150 dpt時，各組在機械刺激后的頻段活動變化.

此研究開發了OBCI系統，將類器官作為移植物，結合BCI提供刺激，促進類器官與宿主大腦的結構和功能整合，以此改善宿主功能。OBCI系統克服了傳統設備在傷腔中的局限性。通過優化柔性電極植入策略，減少感染和損傷風險。研究發現類器官在植入25天后生長良好，適合后續電極的植入。且系統顯示出良好的生物相容性，移植物在長期監測中保持功能信號復雜性的增加。

調控的策略是關鍵。實驗表明，恒流、雙相方波信號是安全有效的刺激形式。通過參數優化，證實50Hz和50μA為最佳刺激條件，可以顯著的提升移植物功能成熟度。刺激還能促進細胞增殖、血管生成和神經元分化，加強移植物與宿主的整合。通過探索刺激頻率的效果，發現70Hz顯著增強移植物與宿主間的功能相關性。OBCI系統展示了在腦損傷修復中的潛力，未來為疾病治療提供了新平臺。

Reference：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-53858-2

翻譯整理：BrainGeek

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