研究概述

本研究報告了一例74歲男性患者的罕見膠質母細胞瘤，主要生長在軟腦膜。患者表現出頭痛、手抖和認知障礙，MRI顯示腦干和小腦軟腦膜增強，但未見明顯的瘤塊。細胞游離DNA（circulating free DNA, cfDNA）是指在血液或其他體液中游離存在的DNA片段。這些DNA片段通常源自多種細胞，包括腫瘤細胞、凋亡或壞死的正常細胞。cfDNA的分析在醫學研究和臨床診斷中具有重要意義。cfDNA可以用于檢測腫瘤特異性突變，幫助診斷癌癥、監測腫瘤進展和評估治療反應。盡管傳統細胞學分析未能檢測到腫瘤細胞，通過腦脊液中的細胞游離DNA納米孔測序，研究人員成功識別出TERT啟動子突變和特征性的拷貝數變異。此方法顯示了腦脊液DNA的潛力，作為一種快速且微創的診斷工具，為高級別膠質瘤的確認提供了有力證據。這一發現為臨床醫生在處理類似病例時提供了新的見解，也提供了明確的診斷依據，有助于制定后續的治療方案。

病例報告

患者為74歲的男性，癥狀為頭痛、手抖、步態不穩及認知障礙，并在前過去兩個月內逐漸加重。患者既往有前列腺癌病史，5年前接受了放射治療，2個月前在回腸末端發現神經內分泌腫瘤（neuroendocrine tumor，NET）1級。腦MRI顯示：未見腦實質內病變，腦干、小腦及顱神經周圍軟腦膜可見強化（圖1a）。當時的鑒別診斷包括“神經炎癥性疾病”和轉移性疾病（不除外前列腺癌的軟腦膜轉移和1級NET）。除回腸NET外，PET-CT掃描未發現顱外原發腫瘤或轉移性病灶。腰椎穿刺獲取的腦脊液顯示白細胞數量輕度增加(14個細胞/μl），葡萄糖水平正常（2.9 mmol/l），總蛋白水平增加（8.75 g/l），與軟腦膜轉移性疾病一致。在第三次腰椎穿刺時，腦脊液的細胞學和循環腫瘤細胞分析仍然為陰性。然而，對cfDNA的下一代測序顯示，端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）啟動子突變，加強了患者實際上患有軟腦膜惡性腫瘤的假設。

圖1：臨床診斷學圖。a MRI增強像顯示小腦和腦橋周圍的強化灶（I、II中的箭頭）。兩側顱神經VII、VIII的強化（III中的箭頭）。b腦脊液DNA測序所得序列reads的大小分布。c 通過納米孔測序獲得的CNV圖譜。d腫瘤分類為膠質母細胞瘤-MID

研究者選擇對腦脊液進行納米孔測序。從2 ml的腦脊液中提取了約200 ng的DNA。使用調整后的文庫準備方案，對100 ng的樣本進行測序，得到1800萬reads。映射的讀長顯示了cfDNA典型的大約 150個堿基對周期性（圖1b），大部分片段在143-175個堿基對范圍內。拷貝數變異（copy-number variation，CNV）特征（圖1c）顯示了出某些變化，包括PDGFRA和MDM4增益和CDKN2A/B損失，高偏差表明腫瘤分數高。在完整或下采樣數據集上進行DNA甲基化分析，得到了膠質母細胞瘤、亞型中線（GBM-MID）的高可信度評分（圖1d）。進行DNA甲基化分析確定了GBM-MID的分類以及CNV譜的改變。

考慮到顱內疾病和臨床惡化，患者得到了最好的支持治療。但是，患者的病情迅速惡化，很快就去世了。病理顯示了分散性增厚和不透明軟腦膜，尤其是在額葉（圖2a)、小腦和腦干周圍。肉眼觀察未發現腦實質內有腫瘤腫塊。在顯微鏡下，腫瘤細胞在整個軟腦膜中廣泛出現浸潤（圖2b）。顯微鏡下顯示腫瘤在腦實質內略微生長，在腦室的室管膜下方（圖2c、d）和中腦的皮質下方存在彌漫性浸潤性生長。腫瘤細胞呈星形膠質細胞形態，細胞核高度不典型，染色質粗糙（圖2d）。免疫組化證實了腫瘤的膠質性質（Olig2；圖2e）。偶爾觀察到有絲分裂象，但缺乏壞死和明顯的微血管增生。值得注意的是，腫瘤細胞增殖活性通過Ki-67染色顯示為中至高度（約20-30%；圖2f）。這些病理結果結合TERT啟動子突變的鑒定，使得可以進行膠質母細胞瘤（IDH野生型）的組分子診斷，這與患者生前腦脊液納米孔測序所建議的診斷完全一致。

圖2：病理。腦切片顯示軟腦膜渾濁增厚（a，白色箭頭）。顯微鏡下，非典型細胞彌漫分布在軟膜腔內（b）。在某些區域，這些細胞也略微存在于室管膜下/腦室周圍，例如靠近海馬（c，d，方框），在相鄰的深層腦溝中，這些細胞的積累更為密集（*）。Olig-2（e）和Ki-67（f）的免疫組化染色分別確認了腫瘤的膠質性質和增殖活性。L：軟膜；CTX：大腦皮層的分子層；HE：蘇木精-伊紅染色。

1.研究者報告了一例IDH野生型膠質母細胞瘤，其主要生長在軟腦膜。這類病例既往很少有報道，診斷非常具有挑戰性。利用腦脊液cfDNA的納米孔測序，進行DNA甲基化分類是一種快速和微創的方法，以獲得直接的診斷建議。

2.研究者假設從腦脊液中回收的大量腫瘤DNA是由于腫瘤細胞與腦脊液之間的大面積地接觸。在小且局限性的腫瘤中，cfDNA的獲取和測序可能更具挑戰性。TERT啟動子突變的發現、CNV特征的變化以及高置信度的分類為高級別膠質瘤/膠質母細胞瘤的診斷提供了充分的證據。

3.準確的診斷對患者及其家屬非常有幫助，因為這為繼續進行姑息治療奠定了基礎。

參考文獻：Sol Nik,Kooi Evert-Jan,Pagès-Gallego Marc et al. Glioblastoma, IDH-wildtype with primarily leptomeningeal localization diagnosed by nanopore sequencing of cell-free DNA from cerebrospinal fluid.[J] .Acta Neuropathol, 2024, 148: 35.