引言

酒精性脂肪肝（AFLD）是酒精性肝病的早期階段，在全球范圍內(nèi)導致大量死亡，至今仍沒有治療 AFLD 的特效療法。多糖是天然生物大分子，具有多種藥理作用，同時也是生物體的能量來源和組成。來自于傳統(tǒng)中藥的天然多糖影響血脂調(diào)節(jié)，可能成為治療 AFLD 的重要藥物。山茱萸常用于治療肝腎疾病，包括非酒精性脂肪肝和糖尿病腎病。

西北農(nóng)林科技大學及空軍醫(yī)科大學藥學院研究團隊從山茱萸中分離出了一種新型酸性均質(zhì)多糖 APFC-2，驗證了APFC-2的結(jié)構(gòu)特征及其對AFLD的作用機理，在《Carbohydr Polym》上發(fā)表《Structure characteristics of a novel pectic polysaccharide from Fructus Corni and its protective effect on alcoholic fatty liver》一文。

研究結(jié)果

一、山茱萸多糖的制備及其對酒精誘導的肝細胞的保護作用

• 建立了酒精誘導的人類肝臟 HepG2 細胞模型，評估 APFC 中提取的 APFC-1、APFC-2 和 APFC-3三種多糖對細胞增殖的影響，篩選出潛在的活性多糖。結(jié)果表明，用 CCK-8 法測定，HepG2 細胞在乙醇處理后活力明顯下降。與 APFC-1 和 APFC-3 相比，APFC-2 具有濃度依賴性，可減輕乙醇誘導的細胞損傷。
  

二、APFC-2 的鑒定和成分分析

圖1 APFC-2 的鑒定和成分分析

• APFC-2 是一種酸性多糖。
  

三、APFC-2-R 的核磁共振分析

圖2 APFC-2-R 的一維和二維核磁共振分析

四、APFC-2 的核磁共振分析

圖3 APFC-2 的 NMR分析

• 通過核磁共振譜分析，APFC-2 是一種均相多糖，呈果膠樣結(jié)構(gòu)。
  

圖4 APFC-2 的推導結(jié)構(gòu)

• 根據(jù)單糖組成、甲基化和核磁共振數(shù)據(jù)，可以推斷出 APFC-2 的結(jié)構(gòu)。
  

五、APFC-2 對體內(nèi) AFLD 的治療作用

圖5 APFC-2 對體內(nèi) AFLD 的治療作用

• 使用 30% 酒精誘導 AFLD 小鼠模型評估 APFC-2 對 AFLD 的體內(nèi)治療效果，正常對照組小鼠口服生理鹽水，GSH作為陽性對照。APFC-2治療模型組的肝臟指數(shù)明顯高于正常對照組，表明AFLD模型建立成功。APFC-2能明顯降低對照模型的肝臟指數(shù)，H&E染色顯示，對照模型小鼠的細胞質(zhì)空泡化、細胞核變窄和肝臟脂肪變性。使用 GSH 或 APFC-2 治療四周后，酒精誘導的肝細胞損傷與載體對照模型相比有所減輕，與 GSH 相比，高劑量 APFC-2 治療組對酒精誘導的肝損傷具有明顯的保護能力。與酒精誘導的對照模型中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的明顯升高相比，APFC-2 治療后這些血清指標降低。

• 評估血清脂質(zhì)代謝物，包括膽固醇（CHO）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯（TG）。與正常對照組相比，載體對照模型組血清中的 TG、TC 和 LDL 水平明顯升高，HDL 水平顯著降低，而 APFC-2 可改善模型小鼠的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物。對照模型的血清 Glc 水平明顯升高，而 APFC-2 處理的小鼠血清 Glc 水平則呈劑量依賴性下降。

• 這些結(jié)果表明，APFC-2 通過改善體內(nèi)異常脂質(zhì)代謝，保護肝細胞，對 AFLD 具有潛在的治療作用。
  

六、APFC-2 可減輕酒精引起的體外脂質(zhì)和葡萄糖代謝紊亂

圖6 APFC-2 對 5 % 酒精誘導的 HepG2 細胞增殖和代謝平衡的影響

• 建立體外AFLD模型，將HepG2細胞在含5%酒精的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。CCK-8結(jié)果顯示，用APFC-2處理的正常HepG2細胞的增殖無明顯變化。與正常細胞相比，酒精誘導組的細胞活力降低，但APFC-2 在 0.03 至 30 mg/L 的濃度范圍內(nèi)對酒精誘導的細胞損傷具有抑制作用。

• 乙醇刺激后，HepG2 細胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的脂滴，但 APFC-2 可濃度依賴性地緩解脂質(zhì)沉積，在 30 mg/L APFC-2 處理的細胞中，脂質(zhì)含量顯著下降。

• 酒精刺激細胞后，細胞內(nèi)的FFA、TG和CHO含量顯著增加，但APFC-2降低了酒精處理細胞內(nèi)的FFA、TG和CHO含量。與對照組相比，模型組細胞內(nèi) CPT1 的含量降低，APFC-2 以濃度依賴性的方式抑制了這種降低。

• LC-MS/MS 對暴露于酒精的 HepG2 細胞中的主要糖酵解代謝物（包括 G6P、FBP 和 GAPDH）進行檢測，酒精明顯抑制了這些糖酵解代謝物。

• 這些結(jié)果表明，APFC-2 可抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)積累，促進酒精誘導肝細胞的糖酵解。
  

七、APFC-2 可抑制酒精誘導的 HepG2 細胞和 AFLD 小鼠肝臟中升高的 LKB1/AMPK 通路

圖7 APFC-2 在酒精誘導的 HepG2 細胞和 AFLD 小鼠肝臟中

誘導 LKB1/AMPK 通路的激活

• Western 印跡法定量檢測 SREBP1 和 PPARα 的豐度，結(jié)果表明，酒精刺激細胞核和細胞質(zhì)時 SREBP1 表達的增加分別被 APFC-2 的濃度依賴性降低。酒精刺激后 PPARα 的表達明顯減少，而 30 mg/L 的 APFC-2 可使細胞核和細胞質(zhì)中 PPARα 的水平增加。用 APFC-2 治療后，模型小鼠肝組織中 SREBP1 和 PPARα 水平的變化與體外細胞實驗中觀察到的變化一致。

• 這些結(jié)果表明，APFC-2 通過減少脂質(zhì)合成和增加脂質(zhì)氧化來減少酒精誘導的脂肪積累。

• 通過測量 LKB1 和 AMPK 的磷酸化水平，進一步分析激活信號。酒精刺激后，HepG2 細胞中的 P-LKB1 和 P-AMPK 明顯降低。APFC-2 濃度依賴性地增加了 P-AMPK 和 P-LKB1 的水平，30 毫克/升的 APFC-2 可使它們的表達量分別增加。

• 這些研究結(jié)果表明，APFC-2 可以有效地激活 AFLD 小鼠肝臟和酒精誘導的 HepG2 細胞中被酒精抑制的 LKB1/AMPK 通路。
  

八、APFC-2 通過 LKB1/AMPK 通路調(diào)節(jié)酒精作用下 HepG2 細胞的脂質(zhì)代謝

圖8 APFC-2 通過 LKB1/AMPK 通路調(diào)節(jié)酒精作用下

HepG2 細胞的脂質(zhì)代謝

• siRNA敲除HepG2細胞中的LKB1，Western印跡表明，敲除 LKB1 對總 AMPK 的表達沒有明顯影響，但 siLKB1 會明顯下調(diào)其磷酸化水平。LKB1在AMPK活化過程中起著重要作用，而APFC-2能靶向LKB1調(diào)節(jié)AMPK信號通路。

• 測量 LKB1 敲除細胞中的胞內(nèi)脂滴，酒精刺激后，siLKB1 細胞內(nèi)脂質(zhì)積累明顯高于 siCon 細胞。APFC-2處理不能明顯降低暴露于酒精的LKB1基因敲除細胞的細胞內(nèi)脂質(zhì)積累，表明APFC-2通過激活LKB1調(diào)控細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。在酒精誘導的細胞中，LKB1 敲除顯著增加了 FFA、TG 和 CHO 的含量；APFC-2 處理并不能進一步改變 siLKB1 細胞中這些物質(zhì)的含量。與 siCon 細胞相比，siLKB1 細胞中 CPT1 的水平在酒精暴露后明顯下降，而 APFC-2 處理對酒精作用下 LKB1 敲除細胞中 CPT1 的水平?jīng)]有明顯影響。

• 這些結(jié)果表明，APFC-2 通過激活 LKB1 調(diào)節(jié)酒精誘導的 HepG2 細胞的脂質(zhì)代謝。

• 通過CCK-8測定APFC-2靶向LKB1對細胞活力的影響，與 siCon 細胞相比，LKB1 基因敲除明顯抑制了模型細胞的活力，但在酒精刺激下，APFC-2不能提高LKB1基因敲除細胞的活力，表明當細胞轉(zhuǎn)染siLKB1時，APFC-2不能恢復酒精刺激導致的細胞活力下降。

• 這些結(jié)果證明，APFC-2可通過LKB1/AMPK途徑緩解酒精引起的脂質(zhì)紊亂和肝細胞損傷。

研究結(jié)論

本研究從山茱萸中分離純化出了一種新型抗AFLD多糖APFC-2。APFC-2是一種典型的含有HG和RG-I結(jié)構(gòu)域的果膠多糖，能夠通過調(diào)節(jié) LKB1/AMPK 信號通路，明顯改善酒精誘導的 HepG2 細胞和 AFLD 小鼠肝臟的肝脂肪變性，表明 APFC-2 可作為一種潛在的新型抗 AFLD 藥物。

注：文章僅用于學術(shù)交流，不作為任何商業(yè)用途。

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