【寫在前面】：本期推薦的是由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)等研究團隊近期發(fā)表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示淫羊藿提取物通過靶向調(diào)控ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬治療肝細胞癌。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

The pathogenesis of hepatocellular carcinoma: ERK/ULK1/ NCOA4-mediated inhibition of iron autophagy, and Epimedium extract targeted modulation of this pathway to treat hepatocellular carcinoma

背景：肝細胞癌（HCC）的發(fā)病機制具有復(fù)雜性和多樣性，涉及糖酵解、自噬及細胞免疫等過程。值得注意的是，以往研究未曾報道過ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制在HCC發(fā)病機制中的作用。本研究對HCC發(fā)病機制作出新闡釋，并依據(jù)此機制將臨床輔助治療藥物淫羊藿（Epimedium）確定為潛在療法。該研究闡明了淫羊藿在治療HCC時對ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制通路的調(diào)控作用，為臨床治療策略及創(chuàng)新藥物研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。

目的：本研究旨在揭示HCC發(fā)病機制新方面，即ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制，并依據(jù)此機制篩選臨床靶向輔助治療藥物。

方法：采用N-亞硝基二乙胺（DEN）誘導(dǎo)建立HCC大鼠模型。借助體重、臟器指數(shù)等指標評估HCC大鼠生理狀態(tài)。通過蘇木精-伊紅（HE）染色及生化標志物對HCC大鼠肝臟損傷情況進行評估。同時，運用非靶向代謝組學(xué)探索HCC發(fā)病機制。采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡明新機制、預(yù)測通路靶點、篩選活性成分及分析淫羊藿（EPME）調(diào)控的生物過程與信號通路。用不同濃度EPME處理DEN誘導(dǎo)的肝癌大鼠，并通過Western blot分析評估蛋白表達水平。利用分子對接技術(shù)評估EPME核心成分與靶蛋白的結(jié)合親和力。采用HepG2肝癌體外模型并結(jié)合抑制劑（SBI-0206965）驗證EPME及其活性成分對ERK/ULK1/NCOA4信號通路的調(diào)控作用。采用微尺度熱泳（MST）技術(shù)驗證EPME核心成分與ULK1蛋白的結(jié)合能力。

結(jié)果：代謝組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)揭示了HCC一種新的發(fā)病機制，即ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制。淫羊藿通過淫羊藿苷、黃芪苷、大黃素等活性成分可激活ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬，從而改善患HCC大鼠的存活條件，減輕肝臟損傷和致癌性，最終在HCC治療中取得療效。

結(jié)論：ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制是HCC治療新機制。臨床輔助藥物淫羊藿提取物（EPME）通過激活ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬，可能對HCC發(fā)揮治療作用。

（圖文摘要）

【前言】

肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，死亡率位居腫瘤第二位。肝細胞癌（HCC）約占肝癌病例的 90%，對人類健康構(gòu)成重大威脅，并且是一個緊迫的全球衛(wèi)生挑戰(zhàn)。目前，手術(shù)治療主要適用于早期肝癌，而中晚期肝癌的治療則主要依賴藥物管理。研究表明，HCC 的發(fā)病機制與糖酵解、自噬以及細胞免疫等機制有關(guān)。然而，由于 HCC 發(fā)病機制的復(fù)雜性和多樣性，目前對其認識仍然不完整，需要進一步研究其具體機制。因此，推進 HCC 發(fā)病機制的研究并開發(fā)針對性的治療藥物是當(dāng)務(wù)之急。

近期研究強調(diào)了在 MAPK 信號通路中，EGFR/ERK 軸在 HCC 的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，影響著 HCC 細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，鐵蛋白自噬的關(guān)鍵受體 NCOA4 在 HCC 中過度表達，導(dǎo)致鐵自噬通量增加，進而使 HCC 細胞內(nèi)自由鐵水平升高，引發(fā)芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），從而抑制 HCC 的增殖。研究表明，NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬受 MAPK 信號通路調(diào)控。基于代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)合研究，本研究發(fā)現(xiàn) EGFR/ERK 和 NCOA4 均對 HCC 的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。因此，推測 EGFR/ERK 與 NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬之間存在密切聯(lián)系，并初步推斷 ERK/ULK1/NCOA4 可能會刺激 HCC 細胞中的鐵自噬。

根據(jù)現(xiàn)代研究，EGFR/ERK 突變出現(xiàn)在多種癌癥中，包括肝癌、肺癌和食管癌，影響癌細胞的增殖和遷移。此外，文獻表明，PI3K/AKT/mTOR 自噬可以抑制胰腺癌；UBE2F-SAG 軸介導(dǎo)的 RHEB 增強 mTOR 活性，加劇肝癌的發(fā)展；PINK1 影響線粒體鐵積累，促進結(jié)腸癌；而 NCOA4 介導(dǎo)鐵自噬并影響胃癌的發(fā)生。上述研究確定了 EGFR/ERK 信號與自噬反應(yīng)在多種癌癥類型發(fā)病機制中的關(guān)系。通過相關(guān)文獻研究，還發(fā)現(xiàn)鐵自噬在 HCC 發(fā)展中的作用與其它癌癥中的作用存在差異。然而，到目前為止，尚未建立 EGFR/ERK 與 ULK1/NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬之間的聯(lián)系。

淫羊藿最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，目前在臨床上作為一種中藥制劑，用于抗腫瘤單體聯(lián)合治療。它在治療 HCC 方面表現(xiàn)出顯著的療效，與單一療法相比，能顯著提高患者的存活率。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿主要通過減輕炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫功能來抑制腫瘤生長。然而，目前尚無關(guān)于 ERK/ULK1/NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬在 HCC 治療中的應(yīng)用報道。本研究旨在探討 HCC 的新發(fā)病機制，并篩選針對這些新發(fā)現(xiàn)通路的臨床相關(guān)輔助藥物。

【結(jié)果】

1、大鼠生理指標

對照組大鼠健康，毛發(fā)亮澤，行為正常，而模型組大鼠食欲、活動力下降，毛發(fā)晦暗雜亂。在EPME治療期間，藥物組大鼠狀態(tài)優(yōu)于模型組，毛發(fā)更光滑整潔，無嚴重脫發(fā)、掉牙等不良癥狀。模型組大鼠體重顯著低于對照組（

p

< 0.01 ），而EPME治療組體重高于模型組和CTX組（

p

< 0.01 ），表明EPME提高了肝癌大鼠的生活質(zhì)量，并呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系（圖1A）。

隨著肝組織充血和炎癥的發(fā)展，肝體比增加，預(yù)示著肝臟病理變化。結(jié)果顯示，模型組的肝指數(shù)顯著高于對照組（

p

< 0.01 ），而治療組的肝指數(shù)低于模型組（p < 0.01）。EPME高劑量組的肝指數(shù)與CTX組相近（p > 0.05）。同時，胸腺和脾臟反映免疫狀態(tài)，可間接評估藥效。模型組脾臟指數(shù)升高，胸腺指數(shù)顯著降低（

p

< 0.01），表明免疫功能下降。EPME組脾臟指數(shù)下降，胸腺指數(shù)隨劑量增加而升高（

p

< 0.01），接近對照組水平。CTX組與模型組在脾臟和胸腺指數(shù)上無顯著差異（

P

>0.05），說明CTX在治療肝癌的同時損害免疫功能，而EPME在保護免疫系統(tǒng)方面優(yōu)于CTX（圖1B）。

大鼠肝臟組織評估及HE染色

對照組大鼠肝臟組織柔軟、亮澤、呈紅色。相比之下，模型組肝臟組織變硬，布滿大的白色囊泡狀結(jié)節(jié)，部分直徑超過1.5毫米。而EPME劑量組的肝臟組織比模型組更柔軟，白色結(jié)節(jié)更少，表面有一些小丘疹樣突起，呈劑量依賴性。CTX組肝臟組織與對照組相似，表面更光滑，但顏色稍暗，EPME高劑量組與CTX組相似（圖1C）。

在顯微鏡下（200倍）觀察各組大鼠肝臟組織的HE染色情況。對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，大小一致，胞漿均勻，核大而圓。模型組個別肝小葉中完全纖維化細胞的核呈藍色染色且聚集，肝細胞之間界限模糊，出現(xiàn)如脂滴聚集的小空泡。與模型組相比，其余各組肝臟組織結(jié)節(jié)更少，更接近對照組。其中，EPME高劑量組和CTX組的肝細胞最接近對照組（圖1D）。這些結(jié)果表明EPME對肝癌的治療效果與CTX相當(dāng)。

大鼠生化指標檢測

對各組大鼠血清中甲胎蛋白（AFP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、afu（AFU）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）這五個指標的水平進行了統(tǒng)計分析（圖1E）。與對照組相比，模型組這五個指標的表達顯著升高（

p

< 0.01）。相對于模型組，EPME組這五個指標的水平顯著降低（p < 0.01），并且隨著劑量的增加而降低。此外，EPME高劑量組對上述指標的調(diào)節(jié)作用與CTX相當(dāng)（

p

> 0.05），除了GGT顯著改善（

p

< 0.01）。

2、大鼠肝細胞癌的發(fā)病機制

為了進一步探討肝細胞癌的發(fā)病機制，通過非靶向代謝組學(xué)分析研究了肝癌大鼠的血清代謝。OPLS-DA結(jié)果顯示，對照組和模型組大鼠分布在兩個區(qū)域，表明DEN誘導(dǎo)的肝癌大鼠體內(nèi)代謝發(fā)生了變化。此外，正負離子模式下的R2和Q2值接近1，表明模型的準確性和預(yù)測能力良好（圖2A-B）。通過比較對照組和模型組之間的差異代謝物，發(fā)現(xiàn)肝癌大鼠體內(nèi)共有48種化合物發(fā)生變化（FC≥2且p < 0.05），主要涉及甘油磷脂代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-錨生物合成、萜類骨架生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化以及谷胱甘肽代謝（圖2C，表1，表2）。

使用EPME對肝癌大鼠進行干預(yù)，并比較了EPME高劑量組、對照組和模型組之間的差異。結(jié)果表明，PCA圖顯示各組之間存在分散，表明EPME影響了肝癌大鼠的代謝（圖2D）。此外，OPLS-DA結(jié)果顯示，EPME組大鼠更接近對照組（圖2E）。在EPME組和模型組之間鑒定了40種差異代謝物（FC≥2且p < 0.05）（表1），其中12種顯著上調(diào)，28種下調(diào)。相關(guān)的代謝途徑與肝癌大鼠觀察到的相似（表3，圖2F），其中甘油磷脂代謝是最顯著的途徑，也存在于肝癌大鼠中。關(guān)鍵差異代謝物是MEA和PE，它們與MAPK信號通路中的EGFR/ERK信號高度相關(guān)（Yang等，2024）。通過文獻研究發(fā)現(xiàn)，EGFR/ERK信號通路影響肝細胞癌的發(fā)生和發(fā)展（Han等，2023）。

3、淫羊藿（EPME）成分分析

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）對淫羊藿（EPME）進行分析。通過與文獻和標準物質(zhì)對比，在正負離子模式下準確鑒定出EPME中的24種化合物（圖3A-B）。此外，口服給藥后，在血液中檢測到27種化合物，包括20種原型血成分和7種代謝產(chǎn)物（表4、表5，圖3C-D）。

4、ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制對HCC的發(fā)生發(fā)展影響

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，從口服進入血液循環(huán)的27種EPME化學(xué)成分中獲得245個靶點。從疾病數(shù)據(jù)庫中篩選出3356個與HCC相關(guān)的靶點，其中135個與EPME潛在靶點重疊，可能是EPME治療HCC的潛在靶點（圖4A）。基于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)信息進行分析（圖4B），其中黃芪苷、大黃素、淫羊藿苷、山柰素-3-O-鼠李糖苷和新橙皮苷影響核心靶點（圖4C），可能在EPME治療HCC中發(fā)揮類似調(diào)節(jié)作用。基于Metascape數(shù)據(jù)庫（ ）分析，EPME治療HCC最顯著的通路是癌癥中MAPK的EGFR/ERK信號通路（圖4D）。NCOA4是核心靶點之一，是介導(dǎo)鐵蛋白自噬、影響HCC發(fā)生發(fā)展的重要靶點（秀等，2022）。本研究結(jié)合代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步推測，EGFR/ERK與NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬和HCC之間存在密切聯(lián)系。通過Western blotting實驗進一步篩選驗證ERK/ULK1/NCOA4的上下游靶點。

5、EPME靶向抑制ERK激活ULK1/NCOA4治療HCC

Western blotting結(jié)果顯示，EPME顯著降低HCC大鼠中EGFR、KRAS、P-ERK、P-TSC2、Rheb和P-mTOR水平（

P

<0.05，

P

<0.01），增加自噬啟動因子P-ULK1（ser317）水平（

P

<0.05），激活自噬。此外，還顯著降低自噬底物SQSTM1/p62水平（

P

<0.01），增加鐵蛋白吞噬標志物NCOA4水平（

P

<0.05，

P

<0.01）。此外，EPME組中鐵蛋白標志物FTH1（

P

<0.01）和GPX4（

P

<0.01）水平也降低（圖5）。以上結(jié)果證實，EPME靶向抑制ERK可激活ULK1/NCOA4信號通路，在HCC治療中發(fā)揮作用。

6、分子對接分析結(jié)果

已有研究表明，EGFR/ERK信號通路可影響下游自噬通路（鄧等，2023）。為探討EPME在調(diào)控ERK/ULK1/NCOA4通路和增強鐵蛋白自噬治療HCC中的作用，采用分子對接測試EPME活性成分與通路靶點結(jié)合情況。結(jié)果顯示其具有強結(jié)合親和力，其中ULK1與大黃素結(jié)合能最高（12.2 kcal/mol），其次是ULK1與淫羊藿苷、NCOA4與大黃素以及GPX4與淫羊藿苷（均為11.1 kcal/mol）（圖6，表6）。初步驗證EPME可能通過調(diào)控ERK/ULK1/NCOA4通路治療HCC。

淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷可結(jié)合表皮生長因子受體（EGFR）的8個位點，如天冬酰胺-469（ASN-469）、半胱氨酸-207（CYS-207）和亮氨酸-445（LEG-445）；可結(jié)合細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）的8個位點，如天冬氨酸-353（ASP-353）、天冬氨酸-123（ASP-123）和甲硫氨酸-125（MET-125）；可結(jié)合 UNC-51 類激酶 1（ULK1）的13個位點，如半胱氨酸-95（CYS-95）、賴氨酸-51（LYS-51）和丙氨酸-28（ALA-28）；可結(jié)合核受體輔激活因子4（NCOA4）的6個位點，包括纈氨酸-685（VAL-685）、亮氨酸-704（LEU-704）和半胱氨酸-669（CYS-669）；可結(jié)合p62的7個位點，包括精氨酸-9（ARG-9）、絲氨酸-13（SER-13）和天冬酰胺-37（ASN-37）。淫羊藿苷和黃芪苷與ULK1的結(jié)合位點均為谷氨酸-93（GLU-93）。淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷與p62的結(jié)合位點均為精氨酸-9（ARG-9）。淫羊藿苷和黃芪苷與p62的結(jié)合位點均為精氨酸-9（ARG-9）、天冬氨酸-39（ASP-39）和絲氨酸-13（SER-13）。為證實用藥促進鐵自噬來治療肝細胞癌（HCC），采用體外培養(yǎng)的人肝癌細胞系HepG2和淫羊藿多糖（EPME）聯(lián)合自噬抑制劑 ULK1 進行后續(xù)驗證。

7、EPME 對 HepG2 細胞增殖的抑制作用

由于中藥的多成分特性，在體內(nèi)的 HCC 實驗中，根據(jù)分子對接結(jié)果，篩選出淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷的前三位結(jié)合位點進行后續(xù)實驗。CCK8 分析顯示，與模型（HepG2）組相比，EPME、淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷的劑量顯著以濃度依賴性方式抑制細胞增殖（

p

< 0.01）。EPME、淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為 2.443 mg/mL、276.10 μM、60.63 μM 和 114.9 μM（圖 7A）。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們選擇了 EPME（2.5 mg/mL）、EPME + SBI-0206965（2.50 mg/mL + 10 μM）、淫羊藿苷（280.00 μM）、大黃素（62.00 μM）和黃芪苷（115.00 μM）進行后續(xù)實驗。CCK8 檢測結(jié)果顯示，各給藥組均能促進 HepG2 細胞在體外的死亡（

p

< 0.01）。此外，在使用自噬抑制劑 SBI-0206965 處理后，EPME 未能促進 HepG2 細胞的死亡（

p

< 0.01），并且與模型（HepG2）組相比無顯著差異（

p

> 0.05）（圖 7B）。

EPME 在體外增強 HepG2 細胞的自噬反應(yīng)

經(jīng) EPME 以及淫羊藿苷、大黃素、黃芪苷處理后，HepG2 細胞內(nèi)的總鐵和亞鐵水平顯著上升（

p

< 0.01），活性氧（ROS）水平也呈現(xiàn)上升趨勢（

p

< 0.01），并且在電子顯微鏡下觀察到 HepG2 細胞內(nèi)自噬體數(shù)量顯著增加。相比之下，在使用 EPME 聯(lián)合 SBI-0206965 處理后，總鐵、亞鐵和 ROS 水平均顯著低于 EPME 組（

p

< 0.01），自噬體數(shù)量也顯著減少，并且與模型（HepG2）組相比無顯著差異（

p

> 0.05）（圖 7C-E）。為了進一步研究其作用機制，通過 Western blotting 檢測了細胞中 ULK1、ERK1/2、NCOA4 和 GPX4 的水平及其磷酸化形式。

8、EPME 通過激活鐵自噬在體外誘導(dǎo) HepG2 細胞死亡

Western blotting 結(jié)果顯示，EPME 的干預(yù)顯著增加了 HepG2 細胞中 P-ULK1（ser317）和 NCOA4 的水平，同時降低了 GPX4 的水平（

P

< 0.05，

p

< 0.01）（圖 8）。此外，使用 ULK1 抑制劑（SBI-0206965）進一步驗證了 EPME 對 HepG2 信號通路的影響。結(jié)果顯示，EPME 與 ULK1 抑制劑聯(lián)合使用會降低 P-ULK1（ser317）和 NCOA4 的水平（

p

< 0.05，

p

< 0.01），增加 GPX4 的水平（

p

< 0.05，

p

< 0.01），最終抑制 HCC 細胞中鐵蛋白的自噬。此外，發(fā)現(xiàn) EPME + SBI-0206965 組與模型（HepG2）組在各蛋白水平上無顯著差異（

p

> 0.05），這進一步證明了 EPME 通過激活鐵自噬在體外誘導(dǎo) HepG2 細胞死亡。為了進一步探討 EPME 誘導(dǎo)的細胞死亡中的自噬是否對 ERK 信號的反饋機制產(chǎn)生響應(yīng)，我們進一步檢測了各給藥組中 P-ERK 的蛋白表達。結(jié)果顯示，當(dāng) HepG2 細胞中的自噬加劇時，P-ERK 的水平明顯受到抑制（

P

< 0.05）；而 EPME 引發(fā)的自噬抑制則顯著增加了 P-ERK 的水平（P < 0.05）。這些累積結(jié)果表明，EPME 誘導(dǎo)的細胞自噬反應(yīng)對 ERK 信號通路產(chǎn)生了負反饋作用，從而導(dǎo)致 EPME 誘導(dǎo)的 HepG2 細胞死亡增加，這與 HCC 大鼠的體外實驗數(shù)據(jù)一致。

9、MST 分析結(jié)果

測序和酶切驗證了構(gòu)建的 pCZN1-ULK1 重組表達質(zhì)粒的準確性（圖 9A）。在上清液和包涵體中均檢測到了 ULK1 蛋白，且獲得的 ULK1 蛋白純度超過 85%（圖 9B-D）。MST 分析顯示，淫羊藿核心成分（淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷）與核心靶點 ULK1 的結(jié)合親和力隨著復(fù)合物濃度的增加而增強，并伴有蛋白質(zhì)遷移速率加快。擬合曲線呈現(xiàn)出倒置的“S”形，且具有明顯的平臺期，表明存在強的濃度依賴性特異性結(jié)合（圖 9E-H）。ULK1 與這三種分子均顯示出較高的親和力（ULK1-淫羊藿苷 = 39.9 nM；ULK1-大黃素 = 45.8 μM；ULK1-黃芪苷 = 63.5 μM）。總之，分子對接結(jié)果證實這些成分與 ULK1 蛋白具有強結(jié)合能力（< 5 kcal/mol）。體外實驗顯示對肝細胞具有顯著的抗腫瘤作用。結(jié)合 MST 實驗，證實這些成分可結(jié)合 ULK1，調(diào)節(jié) ERK/ULK1/NCOA4 介導(dǎo)的鐵自噬反應(yīng)，抑制肝腫瘤增殖，從而治療肝癌。

肝細胞癌（HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位居世界第二。目前，手術(shù)切除仍是HCC的主要治療方法；然而，對于晚期患者并非首選。因此，深入分析HCC的發(fā)病機制并尋求靶向治療是亟待解決的關(guān)鍵問題之一。現(xiàn)有文獻表明，HCC的發(fā)病機制主要與糖酵解、自噬和細胞免疫有關(guān)。然而，關(guān)于ERK/ULK1/NCOA4通路介導(dǎo)的鐵自噬的研究尚未見報道。因此，深入研究鐵自噬在HCC中的作用并尋找針對該通路的藥物具有重要意義。

在本研究中，通過代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，初步推測ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制影響了HCC的發(fā)生發(fā)展。表皮生長因子受體（EGFR）位于細胞表面，存在于自噬體表面。SQSTM1/p62通過與LC3II相互作用后被包裹進入自噬體，在自噬體表面降解，是細胞自噬溶酶體酶降解過程的重要組成部分。NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬導(dǎo)致細胞內(nèi)Fe2+氧化為Fe3+，并與去鐵蛋白結(jié)合形成鐵蛋白儲存。其中，F(xiàn)TH1是鐵蛋白殼的重要組成部分。NCOA4在鐵噬過程中與鐵蛋白結(jié)合并將其運送到溶酶體進行降解。當(dāng)NCOA4耗竭導(dǎo)致鐵蛋白降解丟失時，細胞內(nèi)鐵的生物利用度降低，細胞內(nèi)鐵離子水平升高，最終導(dǎo)致細胞鐵毒性和死亡。GPX4是一種鐵死亡保護蛋白，通過參與多種氧化還原反應(yīng)，防止ROS積累并抑制細胞膜脂質(zhì)過氧化。因此，抑制GPX4功能可加劇鐵死亡。通過Western blotting實驗進一步驗證了ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)（圖10）。

同時，為進一步探索通過調(diào)節(jié)ERK/ULK1/NCOA4治療HCC的藥物，采用淫羊藿（EPME）等提取物干預(yù)HCC大鼠。結(jié)果顯示，EPME療效顯著，HCC大鼠死亡率顯著降低，肝臟結(jié)節(jié)減少，生活條件和肝臟病理染色改善。EPME干預(yù)后，血清中甲胎蛋白（AFP）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、afu和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平顯著下降。AFP是臨床肝癌篩查的主要指標。肝臟癌變時，其血液水平顯著升高。GGT、ALP、AFU和AST是臨床評估肝功能的關(guān)鍵指標。這些酶主要存在于肝臟組織中，在健康人體內(nèi)長期維持低水平。當(dāng)肝細胞受損時，它們會釋放到血液中，導(dǎo)致血液含量急劇增加。EPME可通過顯著降低上述指標水平，減少肝細胞損傷和肝功能障礙。此外，與CTX相比，EPME提高了肝癌大鼠的存活率，并保護胸腺和脾臟系統(tǒng)免受損傷，更為顯著。目前臨床實踐表明，使用單一化合物聯(lián)合淫羊藿治療晚期肝癌患者時，淫羊藿單獨使用存在一定局限性；然而，與其他藥物聯(lián)合使用時，臨床效果顯著。

此外，血清代謝組學(xué)分析顯示，EPME影響了HCC大鼠的差異代謝物，其中12種上調(diào)，28種下調(diào)。在造模后上調(diào)的差異代謝物中，MEA和PE破壞了甘油磷脂信號通路。它們都是細胞膜的重要組成部分，其水平升高使細胞膜更柔軟、易碎，更容易增殖和分化，與EGFR/ERK信號通路密切相關(guān)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究已證明，藥物口服后經(jīng)胃腸道吸收進入血液循環(huán)，通過血液循環(huán)到達局部或全身組織以達到治療疾病的目的。通過UPLC-Q-TOF-MS分析，EPME口服后共鑒定出27種有效生物活性成分。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)臨床靶點數(shù)據(jù)庫顯示，黃芪苷、大黃素、淫羊藿苷、山柰素-3-O-鼠李糖苷、新橙皮苷和山柰素-3-O-鼠李糖苷影響了核心靶點。此外，通路富集分析表明，MAPK中的EGFR/ERK通路富集，下游通路中的NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬通路被激活。在此基礎(chǔ)上，通過Western blotting實驗驗證了EPME干預(yù)HCC大鼠的相關(guān)通路靶點，證實EPME抑制了ERK激活引起的ULK1/NCOA4激活，在HCC治療中發(fā)揮作用。

為進一步探討ERK/ULK1/NCOA4與EPME的關(guān)系，采用分子對接方法，結(jié)果顯示EPME中的生物活性成分與ERK/ULK1/NCOA4信號通路的核心靶點具有良好的結(jié)合能。此外，淫羊藿苷和黃芪苷與ULK1的結(jié)合位點均為GLU-93，這兩種化合物與p62的結(jié)合位點均為ARG-9、ASP-39、SER-13。這證明了淫羊藿通過多成分、多靶點、多空間協(xié)同作用實現(xiàn)肝癌治療目標。此外，體外HCC模型顯示，淫羊藿苷顯著激活ULK1和NCOA4，抑制GPX4表達，導(dǎo)致自噬激活，細胞內(nèi)鐵蛋白形成增加，細胞內(nèi)ROS含量升高，加劇細胞內(nèi)鐵含量過度死亡。大黃素顯著增加NCOA4活性，增強鐵自噬反應(yīng)中鐵蛋白的合成。黃芪苷顯著抑制ERK活性，激活ULK1和NCOA4，在自噬反應(yīng)中抑制mTOR活性，激活自噬反應(yīng)，加劇肝癌鐵自噬死亡過程（表7）。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪苷具有抗炎、抗癌、抗氧化等作用。它顯著抑制ERK1/2的磷酸化水平，增加癌細胞內(nèi)ROS水平，促進癌細胞死亡。此外，黃芪苷在自噬途徑中上調(diào)自噬流相關(guān)蛋白水平，增強自噬反應(yīng)。大黃素通過MAPK/ERK途徑抑制炎癥誘導(dǎo)的血管生成并促進細胞凋亡。根據(jù)相關(guān)文獻，大黃素激活ULK1信號通路并增強自噬。此外，大黃素介導(dǎo)的NCOA4鐵蛋白自噬通路在結(jié)直腸癌中誘導(dǎo)鐵死亡。根據(jù)現(xiàn)代研究，淫羊藿苷通過上調(diào)ULK1的磷酸化水平誘導(dǎo)自噬，并可加劇肝癌細胞的線粒體自噬，導(dǎo)致細胞死亡。由于中藥的多成分特性，本研究在分子對接中篩選出結(jié)合能最高的生物活性成分。體外細胞實驗驗證了EPME通過抑制ERK和激活ULK1/NCOA4加劇HCC細胞的鐵自噬。通過分子對接，結(jié)合能最高的靶點是自噬促進因子ULK1。因此，推測EPME的活性成分以ULK1為靶點激活鐵自噬，使用ULK1自噬抑制劑SBI-0206965進行后續(xù)實驗。

P-ULK1（ser317）是ULK1的一個位點，當(dāng)ULK1在ser317處磷酸化時，ULK1復(fù)合體被激活，促進或啟動自噬。作為ULK1自噬通路的抑制劑，SBI-0206965顯著抑制了EPME誘導(dǎo)的HepG2細胞鐵死亡。值得注意的是，淫羊藿苷、大黃素、黃芪苷和EPME均增強了HepG2細胞的鐵死亡。鐵自噬檢測結(jié)果顯示，HepG2細胞中總鐵、亞鐵和ROS水平在各給藥組中均有所提高。此外，Western blotting實驗顯示，各給藥組P-ULK1（ser317）和NCOA4水平顯著升高，而GPX4水平顯著降低。此外，EPME聯(lián)合ULK1自噬抑制劑SBI-0206965顯著抑制了HepG2細胞的鐵自噬反應(yīng)。進一步考察ULK1激活或抑制對上游ERK通路的影響。根據(jù)Western blotting結(jié)果，EPME誘導(dǎo)的細胞自噬反應(yīng)對ERK信號通路產(chǎn)生了負反饋作用，加劇了EPME誘導(dǎo)的HepG2細胞鐵死亡。Western blotting結(jié)果還表明，EPME比單獨給藥更有效。此外，MST實驗確認EPME的核心成分（淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷）與核心靶點ULK1具有很強的結(jié)合親和力。

上述結(jié)果表明，ERK/1ULK/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制是肝細胞癌（HCC）的一種新致病機制。此外，淫羊藿提取物（EPME）中的生物活性成分，如淫羊藿素、大黃素和木蘭花堿等，能夠穿透細胞膜，并與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)（如表皮生長因子受體（EGFR）、 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、ULK1和NCOA4）發(fā)生共價結(jié)合，從而抑制ERK及其下游信號通路。這種抑制作用激活了細胞內(nèi)ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵蛋白自噬，有助于HCC的治療。此外，EPME通過多組分、多靶點、多部位的作用機制在HCC治療中發(fā)揮協(xié)同作用。此外，本研究設(shè)置了EPME的低、中、高劑量給藥組，主要研究不同劑量與治療效果之間的關(guān)系，并探討機制調(diào)控趨勢。最大給藥劑量為成人臨床等效劑量的9倍。值得注意的是，關(guān)于EPME長期毒性的報告表明，即使在高達臨床等效劑量160倍的劑量下也無毒性，從而支持了EPME的安全性。此外，淫羊藿與單體化合物聯(lián)合使用已在臨床實踐中用于HCC的治療，與單獨使用抗癌單體化合物相比，顯示出更優(yōu)越的治療效果。在未來的研究中，我們打算通過使用類器官藥理學(xué)模型，進一步優(yōu)化EPME和其他單體化合物的臨床聯(lián)合治療劑量。我們的目標是闡明針對不同HCC患者的最優(yōu)用藥比例、劑量和臨床治療方案。這種方法有望提高臨床治療效果，減少對其他化療藥物的耐藥性，提高患者的生活質(zhì)量，并為淫羊藿在HCC輔助治療中的開發(fā)和利用提供堅實的基礎(chǔ)。

總之，本研究結(jié)合代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以及動物和細胞實驗，證明了ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制是HCC發(fā)生的一種新機制。同時證實，EPME中的生物活性成分如淫羊藿素、大黃素和木蘭花堿等通過靶向抑制ERK，激活ULK1/NCOA4，加劇HCC細胞的自噬，從而在HCC治療中發(fā)揮作用。值得注意的是，EPME通過多組分、多靶點多、部位的機制對HCC治療發(fā)揮協(xié)同作用。因此，我們的研究為進一步探索HCC的致病機制和開發(fā)HCC治療的靶向藥物提供了基礎(chǔ)。

【結(jié)論】

本研究結(jié)合代謝組學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法以及動物和細胞實驗，證實了ERK/ULK1/NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制是HCC發(fā)生發(fā)展的新機制。同時確認淫羊藿提取物（EPME）中的淫羊藿苷、大黃素和黃芪苷等生物活性成分可通過靶向抑制ERK，激活ULK1/NCOA4，加劇HCC細胞自噬，從而發(fā)揮治療HCC的作用。特別值得一提的是，EPME通過多成分、多靶點、多部位機制對HCC治療產(chǎn)生協(xié)同作用。因此，本研究為深入探索HCC的發(fā)病機制及開發(fā)HCC靶向藥物提供了基礎(chǔ)。

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