李斯坐到丞相的位置后，他的兒女也相繼和皇族結親，地位之高無人能及。李斯的長子叫李由，是三川郡守，他請假回咸陽時，李斯在家中給他接風，據說門前的馬車數以千計。李斯看到這種情形感慨道：“以前我的老師說過事情不要搞過了頭，我本是上蔡的平民，街巷里的百姓，皇帝不嫌棄我才能低下，才提拔我到這么高的位置。如今我一人之下，萬人之上，可以說是富貴榮華到了極點！盛極必衰，真是不知道自己將來會如何啊！”李斯害怕權勢的衰退、害怕位置不保，開始整天憂慮。

公元前210年，秦始皇沿海北上，前往瑯琊山，丞相李斯和中車府令趙高隨同前往。秦始皇有二十多個兒子，長子扶蘇因多次直言勸諫而被派到上郡監督蒙恬的軍隊，小兒子胡亥跟從隨行，其他兒子都留在了咸陽。

秦始皇在巡游途中死在了沙丘。趙高誘惑李斯，偽造了一封詔書，廢了長子扶蘇，立胡亥為皇帝，即秦二世。

李斯對趙高的行為和當時的局勢深感不安，他曾多次進諫，都被秦二世拒絕。秦二世把吳廣攻打三川郡、李由無法抵抗的責任，都歸罪到李斯的身上，并責備他身為丞相卻讓天下“群盜”紛起。

李斯深感恐慌，為了保住自己的爵位和俸祿，便給秦二世上表《勸行督責書》，在《勸行督責書》里，李斯一方面勸陛下堅持法治，主張用嚴刑峻法監督和控制群臣，這樣臣下就會奉公守法，不敢作亂，天下安寧，國家富足；另一方面暗示二世要警惕趙高篡權。當時，秦二世昏庸無能，一切都聽信于趙高，對李斯的進諫書置之不理。趙高得知此事，對李斯非常不滿，于是動了殺他的念頭。

秦二世聽從趙高的主意，不再坐在朝廷上接見大臣，二是身居宮中，一切公務都由趙高代替。李斯見自己的進諫書被擱置，便想當面與皇上談談。趙高設下圈套，假裝討好李斯：“我會幫您留意的，只要皇上一有空閑時間，一定立刻通知您！”

趙高確實通知了李斯，可是都是在皇上與美女娛樂的時候，李斯一連三次打擾了二世的游玩興致，二世非常生氣地說：“我沒事的時候不來，一到休息娛樂的時候他就來奏事，是不是存心與寡人作對？”

趙高見目的達到，便趁機陷害說：“當初沙丘之謀，李斯曾參與在內。現在陛下做了皇帝，李斯仍然擔任丞相。我看他這樣做，顯然是想割地封王。況且，李斯的長子李由任三川郡守，楚地盜寇陳勝等人都是李斯鄰縣或同鄉的百姓，所以他們才敢如此橫行造反。他們經過三川郡時，李由不肯派兵出擊。我早就聽聞李斯父子跟陳勝等人有書信往來，而且丞相在朝中的權力比陛下還要大！”

秦二世信以為真，想要查辦李斯，又擔心趙高的話有假，便派人到三川郡查訪李由勾結陳勝等人的罪狀。

李斯指責趙高誣陷良臣，他告誡秦二世趙高有篡權的野心，如不早早除掉，恐生禍患。秦二世不僅不信任李斯，反而擔心李斯殺掉趙高，就暗中把這些話告訴了趙高。趙高說：“丞相憂慮的只有我呀，我要是死了，他就可以干田常干的那些事了！”秦二世一聽，勃然大怒。

此后，農民起義隊伍進一步壯大，秦朝岌岌可危。李斯與右丞相馮去疾、將軍馮劫再次上書進諫，請二世減輕賦稅，停止征發徭役修建阿旁宮。秦二世并不理會李斯的一片忠心，反而斥責李斯說：“現在群盜遍及各地，你身為丞相不盡力禁止，卻讓我停修先帝所要修的阿旁宮，你上有負于先帝，下不為我盡忠，還在相位有何用？”于是派人將三人捕入獄中。馮去疾、馮劫自殺，李斯交由趙高負責審訊。

李斯在獄中被趙高嚴刑拷打，百般折磨，只好承認有謀反的罪行。但是，李斯仍然寄希望于秦二世，幻想他能醒悟過來，赦免自己。因此，在獄中又上書二世皇帝，書中以羅列自己七大罪狀的名義，陳述追隨秦二世三十多年來立下的功績，借以表達自己忠心耿耿，絕無謀反之心。然而李斯的上書最后都落在趙高的手中。

為了不使李斯翻供，趙高又命令手下十多人，假扮成秦二世的使者，對李斯輪番審訊。李斯不知有詐，便更改口供，把實情向這些人陳述，卻遭到趙高一次又一次的嚴刑拷打。

經過這樣的審訊，李斯慘遭折磨，再也不敢陳述實情。后來，二世皇帝派使者前去審訊時，李斯以為與前十余次一樣，都是趙高的黨羽，只好一一亂供，不再申辯。秦二世聽了使者的回報，非常高興地說：“若不是趙高，我差點上了李斯的當。”

秦二世派去調查李由罪狀的使者到達三川郡時，李由已經被項梁的起義軍殺死。使者回來后，趙高便將使者所調查的事情一一篡改，編造了許多李由謀反的罪狀，以此陷害李斯。二世皇帝二年（公元前208年）七月，李斯以謀反罪被判處死刑。

臨刑前，李斯與他的二兒子握手惜別，他感慨地說道：“我的孩子，你還記得嗎？那時候我領著你們的手牽著黃犬，到上蔡東門去獵兔的歡樂場景。看來，這樣的美妙時光大概再也不會有了！”說完，父子二人抱頭痛哭。李斯被腰斬于咸陽街頭，全家老小無一人幸免。

李斯，有能力，但是他的品質又是低劣的，凡事以個人的利害得失為準繩，為了個人利益而幫助小人，最后又被小人所害。可以說是自食惡果、咎由自取。所以說，個人的發展，光看才華是不夠的，最重要的是以品德作根基，兩者兼得，才有可能成就一番事業。