摘要

骨骼肌是體內代謝活動的主要組織，具有多種生理功能。其中，肌纖維類型對肌肉功能和肉質具有決定性作用。許多研究表明，天然產物可以影響骨骼肌的發育，調節肌纖維的形成，并在生理或病理條件下影響肌肉功能。黃芩苷是一種主要來源于黃芩干根的天然黃酮類化合物，據報道，它會影響骨骼肌的葡萄糖代謝和胰島素抵抗。然而，黃芩苷在骨骼肌纖維類型轉換中的作用及其潛在機制尚不清楚。本研究旨在探討黃芩苷對體內外骨骼肌纖維轉化的影響。體外實驗以C2C12細胞為模型，黃芩苷處理濃度為125μM；體內實驗使用C57BL/6J小鼠和斷奶仔豬作為模型。結果表明，黃芩苷可以參與骨骼肌纖維的重塑，促進小鼠和豬從糖酵解纖維向氧化纖維的轉化。這可以通過體內和體外與氧化纖維相關的基因的蛋白質和mRNA表達水平升高、SDH酶活性上調和線粒體復合物表達上調來證明，而與糖酵解纖維相關的蛋白質和信使核糖核酸表達水平降低，LDH酶活性下調。機制研究表明，黃芩苷作為一種小分子，可以靶向并結合p38 MAPK蛋白，增加其表達和磷酸化水平，并激活p38 MAPK/PGC-1α信號通路。總的來說，這些數據表明，黃芩苷通過激活p38 MAPK/PGC-1α信號通路，誘導骨骼肌纖維成分從糖酵解轉變為氧化肌纖維，從而影響肉質。

• 骨骼肌是人體新陳代謝活動的主要組織，具有多種生理功能。肌纖維類型對肌肉功能和肉質起著決定性作用。大量研究表明，天然產物可以影響骨骼肌的發育，調節肌纖維的形成，并在生理或病理條件下影響肌肉功能。黃芩苷是一種天然黃酮類化合物，主要來源于黃芩的干燥根部，能影響骨骼肌的葡萄糖代謝和胰島素抵抗。黃芩苷在骨骼肌纖維類型轉換中的作用及其內在機制仍不清楚。本研究旨在探討黃芩苷在體外和體內對骨骼肌纖維轉換的影響。體外實驗以 C2C12 細胞為模型，黃芩苷處理濃度為 125 μM；體內實驗以 C57BL/6J 小鼠和斷奶仔豬為模型。結果表明，黃芩苷可參與骨骼肌纖維的重塑，促進小鼠和豬的糖酵解纖維向氧化纖維轉化。這表現在體內和體外氧化纖維相關基因的蛋白質和 mRNA 表達水平升高，SDH 酶活性和線粒體復合物表達上調，而糖酵解纖維相關基因的蛋白質和 mRNA 表達水平降低，LDH 酶活性下調。研究發現，黃芩苷作為一種小分子化合物，能靶向結合 p38 MAPK 蛋白，提高其表達和磷酸化水平，激活 p38 MAPK/PGC-1α 信號通路。這些數據綜合表明，黃芩苷通過激活p38 MAPK/PGC-1α信號通路，誘導骨骼肌纖維組成從糖酵解型向氧化型轉變，從而影響肌肉水平。
  

研究結果

一、黃芩苷誘導小鼠和斷奶仔豬骨骼肌肌纖維從糖酵解型向氧化型轉變

圖1 黃芩苷可誘導小鼠的糖酵解肌纖維向氧化肌纖維轉化

• 雄性 C57BL/6J 小鼠喂食 100 毫克/千克黃芩苷，持續 12 周，發現補充黃芩苷后，小鼠體重降低。在懸掛肢體與跑步測試中，肢體懸浮時間和奔跑時間比對照組長。TNNI1、TNNC1 和 TNNT1 是氧化肌纖維的標記基因，而 TNNI2、TNNC2 和 TNNT3 則是糖酵解肌纖維的標記基因。RT-qPCR分析表明，在黃芩苷組的 TA 組織中，氧化肌纖維標記基因 MyHC IIa 和 TNNI1 的 mRNA 表達明顯增加，而糖酵解肌纖維標記基因 MyHC IIb 和 TNNC2 的 mRNA 表達明顯減少。Western 印跡表明，黃芩苷治療組提高了 MyHC 慢蛋白的表達，降低了 MyHC 快蛋白的表達。免疫熒光染色說明，黃芩苷增加了氧化肌纖維的比例，降低了糖酵解肌纖維的比例。這些發現表明黃芩苷誘導了小鼠肌纖維從糖酵解型向氧化型的轉變。
  

圖2 BAI 能促進豬骨骼肌中氧化肌纖維的形成

• 不同濃度 BAI 對斷奶仔豬 LD 肌肉快慢肌標記基因 mRNA 表達的影響。

• BAI處理組和對照組斷奶仔豬LD肌肉中MyHC-Fast和MyHC-Slow的免疫熒光染色和定量分析。

• 斷奶仔豬 LD 肌肉的 H&E 染色和平均橫截面積。

• 這些結果表明，黃芩苷能促進斷奶仔豬肌肉纖維從糖酵解向氧化轉變。
  

二、黃芩苷誘導 C2C12 細胞分化

圖3 BAI 可誘導 C2C12 細胞分化

• 利用 C2C12 細胞作為模型系統，對 10 到 200 μM 的梯度濃度進行了評估，發現 200 μM 黃芩苷能顯著降低細胞活力，具體在 ≥150 μM 黃芩苷能顯著降低細胞活力， 125 μM 黃芩苷處理的細胞活力變化不大。選擇 125 μM 黃芩苷處理 C2C12 細胞，不會影響成肌細胞的增殖或細胞增殖相關基因的 mRNA 表達水平。

• 用黃芩苷處理 C2C12 細胞并誘導其分化 3 天，MyHC 免疫熒光染色結果表明，黃芩苷處理后分化指數明顯增加。Western 印跡分析表明，黃芩苷處理后，成肌分化標記基因 MyHC 和 MyoD 的蛋白表達水平上調。

• 這些結果表明，黃芩苷能促進體外肌原分化。
  

三、黃芩苷通過促進線粒體生成作用來促進氧化型肌纖維的形成

圖3 BAI 通過影響線粒體生成促進氧化肌纖維的形成

• 誘導C2C12細胞分化4天，用125 μM黃芩苷處理，免疫熒光染色顯示，黃芩苷處理后，MyHC-慢速陽性肌管的比例顯著增加，MyHC-快速陽性肌管的比例則下降。RT-qPCR 分析表明，黃芩苷能顯著提高 C2C12 肌細胞中 MyHC I、MyHC IIa 和 TNNI1 的 mRNA 水平，同時降低 MyHC IIb 和 TNNI2 的 mRNA 水平。Western 印跡結果表明，與對照組相比，MyHC-快蛋白水平大幅降低，MyHC-慢蛋白水平升高。這些發現表明黃芩苷促進了成肌細胞內氧化肌的形成。

• 肌肉纖維氧化能力的增強與線粒體生成和功能有關，觀察其對線粒體功能的影響，黃芩苷導致 C2C12 肌細胞管內線粒體膜電位升高。PGC-1α是線粒體生物發生的轉錄調節因子，通過刺激核呼吸因子1（NRF-1）促進線粒體轉錄因子A（TFAM）的轉錄和表達，參與線粒體DNA的轉錄激活，改善線粒體功能。RT-qPCR結果顯示，黃芩苷能上調線粒體豐度（mtDNA/nDNA），并能提高 C2C12 肌管中線粒體生物發生相關基因（PGC-1α、NRF1、TFAM 和 ATP5e）的 mRNA 水平。在電鏡下觀察線粒體的形，發現黃芩苷處理后，線粒體形態良好，線粒體數量和面積增加。Western 印跡和 RT-qPCR 分析表明，與線粒體生物發生相關的基因表達水平有所提高。 ELISA 檢測骨骼肌線粒體中 LDH、SDH 和 HK 的活性，發現黃芩苷能顯著提高小鼠 SDH 的活性，降低 LDH 的活性，但對 HK 的活性沒有顯著影響。

• 這些研究結果表明，黃芩苷可促進體內和體外線粒體的生物生成，最終促進氧化肌纖維的形成。
  

四、黃芩苷通過p38 MAPK/PGC-1 α途徑調節骨骼肌纖維重構

圖5 BAI通過p38MAPK/PGC-1 α途徑調節骨骼肌纖維重塑

• 通過小分子靶蛋白預測和分子對接，確定黃芩苷的靶蛋白，其中 p38 MAPK 蛋白與黃芩苷的結合能力排在前十位。研究表明，p38 MAPK/PGC-1α 是骨骼肌纖維類型轉換和線粒體生物生成的重要調節途徑。p38 MAPK 選為黃芩苷的靶蛋白進行驗證。結果顯示，黃芩苷與 p38 MAPK 的自由結合能為-7.67 kcal/mol，并與 p38 MAPK 的特定殘基形成氫鍵，表明其與 p38 MAPK 蛋白結合穩定。CETSA 評估發現黃芩苷處理后 p38 MAPK 的熱穩定性增加，黃芩苷可以與 p38 MAPK 蛋白結合，并通過提高 p38 MAPK 蛋白的熱穩定性來增加其蛋白表達水平。

• Western印跡法表明，黃芩苷能上調C2C12細胞和小鼠腓腸肌中p-p38 MAPK/p38 MAPK的比例，表明黃芩苷激活了p38 MAPK信號通路。檢測p38 MAPK信號通路下游的一個關鍵轉錄因子PGC-1α的表達水平，發現黃芩苷處理后小鼠腓腸肌中PGC-1α的表達水平顯著升高。使用 p38MAPK 抑制劑（SB203580）處理 C2C12 細胞，蛋白分析表明，SB203580能降低p-p38 MAPK/p38 MAPK的比例和PGC-1α的蛋白表達，表明SB203580抑制了p38 MAPK/PGC-1α信號通路。蛋白印跡分析表明，用SB203580抑制p38 MAPK/PGC-1α信號通路后，黃芩苷對MyHC-slow和MyHC-fast蛋白表達的影響可以消除。免疫熒光染色表明，與 BAI 組相比，BAI + SB203580 組 MyHC-slow 陽性肌管數量明顯減少，而 MyHC-fast 陽性肌纖維數量增加，說明抑制 p38 MAPK/PGC-1α 信號通路抑制了黃芩苷促進糖酵解肌纖維向氧化肌纖維轉化的作用。

• 這些結果表明，黃芩苷通過激活 p38 MAPK/PGC-1α 信號通路促進骨骼肌纖維類型從糖酵解肌纖維向氧化肌纖維轉化。
  

研究結論

綜上所述，黃芩苷增強了線粒體的生物合成，促進了肌肉纖維從糖酵解型向氧化型的轉變。還能靶向 p38 MAPK 蛋白，進而激活 p38 MAPK/PGC-1α 信號通路，促進肌纖維的轉化。這一發現可為黃芩苷調節肌肉纖維比例提供新的依據，也為改善豬肉質量提供理論依據。

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