摘要:在基因治療領域，腺相關病毒（AAV）載體的標準化評估是確保療法安全有效的關鍵。本文將系統梳理 AAV 載體的關鍵質量屬性（CQAs），詳解當前主流分析技術的優勢與挑戰，揭示計量學框架在統一檢測標準中的核心作用，并展望未來表征技術的發展方向，為行業提供從基礎原理到實踐應用的全面指南。

一、AAV 載體：基因治療的 “精準投遞員”

作為基因治療的明星載體，AAV 以其非致病性、免疫原性低的特性，承擔著將治療基因遞送至靶細胞的關鍵任務。這種 20nm 的微小病毒由蛋白質衣殼包裹單鏈 DNA 基因組構成，其結構中的倒轉末端重復序列（ITRs）和 rep/cap 基因（如圖 1 所示）是實現基因遞送的核心元件。然而，AAV 血清型多樣性、批次間差異以及生產過程中的變異性，使得其質量表征成為一項復雜的系統工程。

二、計量學框架：構建 AAV 表征的 “行業標尺”（一）測量科學的核心價值

計量學作為測量的科學，通過建立參考材料、標準化流程和驗證方法，為 AAV 表征提供了 “度量衡”。例如，美國 ATCC 開發的 AAV2 和 AAV8 參考標準材料（RSMs），經 16 個國際實驗室聯合表征，涵蓋了顆粒濃度（ELISA）、基因組滴度（qPCR）、感染滴度（TCID50）等關鍵參數（見表 1），成為跨實驗室數據比對的 “黃金標準”。

（二）溯源性與標準化挑戰

實現國際單位制（SI）溯源是計量學的核心目標，但 AAV 的復雜結構使其難以直接溯源。為此，ISO 20399 和 ISO 16921-2 等國際標準應運而生，從輔助材料控制到病毒載體定量方法，為行業提供了系統性指導。然而，生產工藝差異（如 HEK293 細胞與昆蟲細胞平臺）仍會導致載體特性波動，需通過持續優化測量框架來縮小差異。

三、關鍵質量屬性（CQAs）解析：AAV 的 “體檢指標”（一）滴度測量：從 “數量” 到 “活性” 的雙重驗證

1. 物理滴度：qPCR 和數字 PCR（dPCR）是定量基因組拷貝數的常用方法，但引物靶向區域（如 ITRs 或 EGFP）會顯著影響結果 —— 研究顯示，靶向 ITRs 的 qPCR 結果比靶向表達盒高 3.6-6.1 倍（見表 2）。dPCR 因無需標準曲線、抗干擾能力強，正成為更可靠的選擇，但 AAV 聚集會導致滴度低估。

   
   

2. 感染滴度：TCID50 和感染中心測定（ICA）是評估感染性的經典方法，但兩者結果可能相差 40 倍。例如，AAV8 參考材料的 VG/IU 比值在 TCID50 中更低，提示其對病毒顆粒的檢測更敏感，但需警惕假陽性風險。

1. 衣殼身份與化學計量：質譜（MS）結合液相色譜（LC）可精準區分 AAV 血清型 —— 通過分析 VP1/VP2/VP3 的質量差異，能分辨 AAV1 與 AAV9 等高度同源的血清型。值得注意的是，衣殼蛋白比例并非固定 1:1:10，AAV9 的實際比例可達 3:10:47，且表達平臺會影響 VP1 表達水平（HEK293 細胞高于昆蟲細胞）。

   
   

2. 基因組完整性與甲基化：納米孔測序可直接讀取完整基因組，識別截斷熱點；而甲基化分析顯示，野生型 AAV2 基因組甲基化率僅 0.6%，但整合到宿主后甲基化率飆升至 76%，這可能影響基因表達效率。

PTMs 如磷酸化、糖基化和脫酰胺化等，直接影響 AAV 的感染性和穩定性。例如，AAV2 衣殼 N253Q 糖基化位點突變會導致包裝效率下降 100 倍，而 AAV8 的 N499 糖基化可調控細胞靶向性。不同生產工藝會導致 PTMs 譜差異 —— 昆蟲細胞生產的 AAV8 比 HEK293 細胞具有更豐富的 PTMs（見表 3、4），這提示需建立 PTMs 監測體系以保證批次一致性。

四、雜質控制：AAV 的 “純凈度革命”（一）空衣殼與部分衣殼：“無效載體” 的精準識別

AAV 生產中常伴隨空衣殼、部分基因組衣殼等雜質（如圖 2 所示）。分析超速離心（AUC）和電荷檢測質譜（CDMS）是分離與定量的有效手段 ——CDMS 可通過質量差異區分空衣殼（3.729 MDa）與完整衣殼（5 MDa），結果與電鏡（TEM）高度吻合（誤差 < 1%）。陰離子交換色譜（AEX）則憑借高通量優勢，成為過程監控的優選方法。

（二）DNA 與宿主蛋白污染：“隱形風險” 的深度排查

1. DNA 雜質：單鏈病毒測序（SSV-seq）揭示，CsCl 純化的 AAV 含線粒體 DNA 污染，而親和層析純化的 AAV 則富含染色體 15 序列。更嚴重的是，包裝的質粒 DNA（如 p5 啟動子區域）可能轉錄有毒產物，需通過 ddPCR 靶向 CMV 啟動子等方法嚴格控制。

2. 宿主細胞蛋白（HCPs）：質譜鑒定顯示，AAV 常伴隨 Galectin-3 結合蛋白、核磷蛋白等 HCPs（見表 5），其中 SET 蛋白僅存在于完整衣殼組分中，提示其可能參與衣殼組裝。HCPs 殘留可能引發免疫反應，需開發特異性檢測方法。

   
   

面對基因治療產業化需求，AAV 表征技術正朝三個方向突破：一是開發多維 ddPCR 等單顆粒分析技術，解決聚集干擾問題；二是推進 LC-MS 的高通量應用，實現 PTMs 與血清型的同步分析；三是構建 AI 驅動的質量預測模型，通過過程參數實時監控 CQAs。正如計量學框架的完善將推動行業標準化，這些技術創新將助力 AAV 載體從 “經驗生產” 邁向 “精準制造”。

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