摘要：本文主要介紹了噬菌體展示技術在新型蛋白質藥物發現中的應用。該技術是一種成熟的體外展示技術，通過將肽或抗體片段與噬菌體病毒顆粒上的衣殼蛋白融合，實現表型與基因型的直接關聯，從而快速篩選出特異性結合目標抗原的生物分子。文章闡述了噬菌體展示技術在抗體、納米抗體、替代支架和肽等藥物發現中的應用，介紹了相關的篩選策略、下一代測序技術的作用，以及該技術在其他領域的應用實例，并對其未來發展進行了展望。

一、噬菌體展示技術概述

噬菌體展示技術是體外展示方法的一種，自 20 世紀 80 年代首次用于展示肽以來，不斷發展，如今已廣泛應用于治療性生物活性分子的發現。該技術的核心是通過將肽或抗體片段與噬菌體病毒顆粒上的衣殼蛋白融合，使噬菌體能夠展示這些生物分子，進而直接將表型與基因型聯系起來，實現快速鑒定富集的生物分子群體，以靶向感興趣的抗原（圖 1）。

1.1 抗體的噬菌體展示

抗體片段在噬菌體上的展示主要有兩種形式：噬菌體形式和噬菌粒形式。在噬菌體形式中，所有 pIII 蛋白分子都作為融合蛋白表達，每個噬菌體尖端展示 3 - 5 個拷貝，呈多價展示；而在噬菌粒系統中，大部分 pIII 來自輔助噬菌體，只有一小部分來自噬菌粒，平均每個噬菌體展示不到一個拷貝，呈現單價展示。單價展示有助于常規篩選高親和力克隆，但野生型噬菌體背景較高。

M13 絲狀噬菌體是常用的噬菌體載體，其感染表達 F 菌毛的大腸桿菌菌株，使得在實驗室環境中僅需幾周就能完成快速便捷的發現過程。噬菌粒載體系統則將抗體展示與噬菌體繁殖分離，具有更高的轉化效率，適合構建大型文庫，常用于展示抗體片段和替代支架，而噬菌體載體更適合展示肽（圖 2）。

噬菌體展示技術在治療性抗體發現中發揮了重要作用，已衍生出眾多生物技術公司，如劍橋抗體技術公司等。目前，至少有 19 種基于噬菌體展示的單克隆抗體和納米抗體已獲批準，還有許多處于臨床開發后期（表 1、表 2）。此外，該技術還可與核糖體展示、酵母展示等其他技術協同，以及與下一代測序（NGS）、流式細胞術等結合，提高篩選通量。

抗體庫的構建是抗體發現的關鍵步驟，包括天然文庫、免疫文庫和合成文庫等。天然文庫從非免疫供體中獲取，可分離出針對多種抗原的特異性抗體，但親和力通常較低；免疫文庫通過免疫動物或人類獲得，針對特定目標富集；合成文庫則利用 DNA 合成技術和生物信息學設計，能夠更精準地控制抗體序列，提高抗體的親和力和開發潛力（圖 3）。

1.2 納米抗體（VHH 片段）

納米抗體（VHH 片段）是源自駱駝科動物天然重鏈抗體的最小抗原結合抗體生物制劑之一，具有體積小、溶解性高、穩定性強和組織穿透性好等特點，可用于構建雙特異性、多特異性生物制劑，或與其他分子融合，在抗腫瘤和抗感染治療中具有重要應用前景。

Caplacizumab 是首個獲批的納米抗體藥物，用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜（TTP），通過抑制血管性血友病因子（VWF）與血小板的相互作用發揮作用。此外，還有多種基于納米抗體的生物制劑處于臨床開發階段，如 gefurulimab、ozoralizumab 等，用于治療免疫介導和自身免疫性疾病。

1.3 替代支架的噬菌體展示

除抗體和納米抗體外，噬菌體展示技術還可用于展示多種替代支架，如基于人組織因子途徑抑制劑 Kunitz 結構域的 ecallantide、基于 lipocalin 結構的 Anticalins?、基于葡萄球菌蛋白 A 的 Fc 結合域的 Affibodies? 等。這些替代支架在治療和診斷領域展現出巨大潛力，部分已進入臨床試驗階段或獲批上市。

以基于10FN3結構域的 Monobodies 和 AdnectinsTM 為例，10FN3結構與抗體可變重鏈相似，通過噬菌體展示或 mRNA 展示技術，可篩選出針對特定靶點的高親和力結合劑，如 lerodalcibep 用于治療高膽固醇血癥和心血管疾病。Anticalins? 通過對 lipocalin 結構的四個高變環進行組合設計，實現對目標抗原的特異性結合，可用于治療多種疾病，并在體內成像和診斷方面具有應用價值。Affibodies? 基于葡萄球菌蛋白 A 的 Z 結構域，具有體積小、親和力高的特點，可用于腫瘤診斷、成像和治療，如 izokibep 用于治療多種自身免疫性疾病。

1.4 肽的噬菌體展示

絲狀噬菌體（如 M13）是肽展示的常用載體，肽通常與 pIII 或 pVIII 衣殼蛋白的 N 端融合，長度在 6 - 43 個氨基酸之間，可呈線性或環狀。肽噬菌體展示文庫可包含多達1010個個體肽序列，能篩選出針對多種蛋白質和非蛋白質靶點的特異性肽結合劑。

目前，已有兩種源自噬菌體展示的肽藥物獲批上市，即 ecallantide 和 romiplostim，分別用于治療遺傳性血管性水腫（HAE）和免疫性血小板減少癥（ITP）。此外，肽噬菌體展示還可用于疾病特異性表位鑒定、疫苗設計、藥物靶向遞送等多個領域，在藥物發現過程中具有廣泛的應用前景。

二、噬菌體篩選策略

噬菌體展示篩選過程的關鍵是通過生物淘選（biopanning）富集針對目標抗原的噬菌體克隆。通常使用初始過量的文庫（約1010個噬菌體顆粒）與目標抗原孵育，抗原純度對篩選成功至關重要，可使用肽、重組蛋白或過表達目標蛋白的細胞作為抗原來源（圖 3）。

篩選策略包括固相篩選和液相篩選。固相篩選將抗原固定在塑料表面、ELISA 板孔或珠子上；液相篩選則將抗原生物素化，在溶液中與噬菌體結合后，通過鏈霉親和素包被的磁珠捕獲復合物。液相篩選常用于提高篩選嚴格性，以分離高親和力結合劑。

經過與抗原孵育、洗滌去除非特異性噬菌體后，可通過多種方法洗脫結合的噬菌體，如改變 pH 值、酶消化或使用游離抗原競爭。洗脫后的噬菌體重新感染大腸桿菌進行擴增，通常經過 3 - 5 輪篩選，可富集目標特異性噬菌體結合劑。篩選過程中可采用多種策略，如針對特定屬性（如慢解離速率、pH 敏感性）、特定表位、去除不需要的結合劑等進行篩選，還可用于抗體的結構引導親和力成熟和人源化改造。

2.1 細胞表面篩選（On - cell selections）

細胞表面篩選是一種克服表達困難的膜蛋白受體篩選難題的策略。通過使用過表達膜蛋白的細胞作為抗原來源，在細胞環境中進行篩選，可模擬體內環境。例如，CellectSeq 技術通過原位細胞篩選富集目標特異性噬菌體抗體，結合 NGS 分析和計算機分析鑒定抗原特異性抗體；μCellect 技術則結合微流控技術，在高度嚴格的細胞混合物中快速去除非特異性結合劑，已成功篩選出針對 GPCR FZD7 的皮摩爾親和力抗體。

2.2 體內篩選（In vivo selections）

體內篩選是一種新興策略，通過將噬菌體文庫注射到動物體內，利用細胞和器官靶向原理，篩選與特定組織結合的噬菌體抗體。該策略已在多種疾病模型中成功應用，如鑒定動脈粥樣硬化相關生物標志物、糖尿病相關抗體、腫瘤特異性抗體，以及用于藥物遞送穿過血腦屏障等，為個性化醫療和拓展藥物靶點提供了新途徑。

三、下一代測序（NGS）在抗體發現中的作用

NGS 技術徹底改變了抗體發現的工作流程，通過對噬菌體抗體克隆進行大規模測序，能夠快速鑒定富集的特異性抗體克隆，助力先導化合物的選擇。NGS 不僅有助于原始 VH/VL 配對，還可通過對目標特異性克隆的 CDR DNA 測序數據進行深度挖掘，識別更多相關的 CDR 譜系，以及通過對噬菌體抗體克隆池的測序，鑒定抗體序列簇，從而檢索到罕見的克隆。

NGS 具有速度快、成本低、勞動強度低等優勢，可用于評估文庫質量、分析重鏈種系使用變化、評估 CDR 多樣性等。常用的 NGS 平臺包括 Illumina 系統、Ion Torrent PMG 平臺等，隨著技術的發展，NGS 已能提供更長讀長和更高準確性的測序。

四、噬菌體展示在抗體發現和治療性分子生成中的其他應用

4.1 針對毒素和毒液的治療

噬菌體展示技術可用于生成針對毒素和毒液的抗體，解決傳統抗毒素治療的局限性。傳統抗毒素多為動物源性多克隆抗體，存在生產困難、成本高、供應短缺、批次間差異大、副作用多等問題。而通過噬菌體展示技術，可生成重組單克隆抗體、納米抗體或替代支架，如針對黑曼巴蛇毒、志賀毒素、α - 眼鏡蛇毒素等的中和抗體，以及用于治療其他毒素中毒的抗體和替代支架，這些新型抗毒素具有穩定性高、生產成本低等優勢，有望改善中毒治療效果。

4.2 針對 T 細胞受體上 pHLA/MHC 呈遞肽的治療

Tebentafusp 是一種通過噬菌體展示技術生成的雙特異性肽 - HLA 導向的 CD3 T 細胞銜接器，用于治療葡萄膜黑色素瘤。它通過將修飾的人 TCR 與抗 CD3ε 單鏈抗體片段融合，能夠特異性結合腫瘤細胞上的抗原，招募細胞毒性 T 淋巴細胞，殺傷腫瘤細胞。

4.3 疫苗開發中的表位鑒定

噬菌體展示在疫苗開發的表位鑒定中發揮重要作用。通過展示隨機肽序列或基因片段，篩選患者或接種者血清，可鑒定病原體的表位，用于開發更有效的疫苗，同時還可用于生成傳染病診斷檢測方法。此外，噬菌體展示技術還可用于直接開發基于噬菌體的疫苗，但目前該疫苗形式尚未獲批。

4.4 ORFeome 噬菌體展示

ORFeome 噬菌體展示是一種用于表位映射和鑒定的新技術，通過在噬菌體表面展示病原體基因組的開放閱讀框（ORFs），能夠獨立于轉錄組或蛋白質組檢測免疫原性蛋白，已應用于多種病原體的研究，如蜱、李斯特菌、鉤端螺旋體、SARS - CoV - 2 等，有助于發現生物標志物、開發診斷檢測和疫苗。

五、以 SARS-CoV-2 為例看噬菌體展示技術的應用

在應對 COVID - 19 大流行中，噬菌體展示技術在快速生成抗病毒單克隆抗體方面發揮了重要作用。通過從多種來源構建噬菌體展示文庫，包括人天然抗體文庫、康復患者免疫文庫等，成功篩選出針對 SARS - CoV - 2 的中和抗體。這些抗體主要靶向刺突蛋白的 S1 亞基的受體結合域（RBD），也有部分靶向 NTD 和 S2 區域。

從人天然抗體文庫中篩選出的中和抗體具有高效性，部分抗體已進入臨床試驗階段。面對病毒變異導致的中和抗體效率降低問題，可通過噬菌體展示技術進行親和力成熟改造，提高抗體的親和力和中和能力，或采用針對更保守區域、使用抗體雞尾酒或雙特異性抗體等策略，對抗病毒逃逸。

六、結論與展望

噬菌體展示技術是一種成熟且強大的體外展示系統，在蛋白質藥物發現中發揮著重要作用，通過與其他技術結合和創新策略的應用，不斷拓展其在生物制劑發現和開發中的潛力。未來，隨著人工智能、結構生物學、微流控技術等的不斷發展，噬菌體展示技術有望在藥物發現領域取得更多突破，為治療性生物制劑的開發提供更有力的支持，同時在診斷、生物標志物發現和靶點鑒定等領域也將發揮更大的作用。

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