寫在前面

本文對之前的分享有所刪改，并增添了一些內容補充，本文較長，建議收藏相互印證，過柱子相關的大部分問題將在這里終結。以下為正文部分：

之前和師妹聊天，師妹傳了一個合成群內的聊天記錄，看到一個很有意思的問答，瞬間給笑慘了！

正好值研究生開學，有好幾個同學私信菜籽，讓出一期關于過柱子的方法技巧的分享。總結了許久，從歷史講下來，廢話比較多，三易其稿，不能說多好，大概就全流程走一遍吧，供大家參考。

大家有補充的也可以后臺私信分享，如果有必要，我們可以引用再做一期經驗分享。

菜籽已經在化學行業摸爬滾打十四五年了，之前在藥廠的時候一直覺得拿到一個化合物直接過柱子是一個很low的操作。

因為菜籽是工廠技術出身，所以拿到化合物的第一個想法就是能不能用結晶，打漿，減壓蒸餾，酸堿洗等方法來純化，如果不能的話還會考慮能不能轉化上個保護基啥的，在其他步驟去純化。

過柱純粹是個無奈之舉。

直到后來進到高校，做起來了毫克級別的反應，才發現是菜籽狹隘了，上述方法真的不適用，過柱子真的的很香。

而且目前在菜籽實驗室來講，過柱子的手段太多了，除了人力，還有過柱機，有循環制備型GPC，有高效液相制備，量少了偷個懶是完全可以的。

當然，像菜籽這樣“特權的”人并不多，“ 普通人 ”想要用，是要求他們把傳統柱子過好才可以預約的。

我們常說過柱子其實就是柱層析分離，也叫柱色譜，1903年由俄國科學家首次發明使用，其把植物色素的溶液經過粉碎的碳酸鈣粉末，發現從上到下在碳酸鈣粉末上有不同的色帶，通過對不同色帶的分開提取，得到了較純葉綠素，葉黃素等。

該方法經過經過百年的發展至今已經比較成熟，固定相也從單一的碳酸鈣粉末發展到了氧化鋁（又分為酸性、中性、堿性），硅膠，活性炭等，其中各大實驗室最常用的便是硅膠，一般分為正相硅膠和反相硅膠！

固定相（硅膠）一般要經過純化和活性處理，顆粒大小應當均勻統一，理論上其顆粒越小、同單位質量表面積越大，吸附能力就越高，分離效果也就越好。但是實際使用中固定相的顆粒太小時往往會存在兩個情況：

• 一個是其質更輕，容易飄散在空氣中（硅膠進入人體無法降解，越細越毒）；

• 二是顆粒小也會導致顆粒之間縫隙小，從而使溶劑的流速就太慢，耗時；以硅膠為例，目前已經商業化用量最大的硅膠尺寸為200-300目。

過柱手段這塊，除了前面說的正向循環制備，高效液相制備，過柱機這些自動分析的設備，手動過柱方面主要分為常壓過柱，減壓過柱，加壓過柱三種。其中：

• 減壓過柱 ，因為洗脫劑流速過快，會損失大半部分塔板數，分離效果較差，適合分離TLC板子分的比較開的樣品，尤其適合產物只有一個大極性雜質的樣品；所有其大多數時間被用于化合物的預處理，過掉部分雜質后再仔細純化。 相關內容見：

• 常壓過柱是三者中分離效果最好的一種過柱方式，但是因為很多時候溶劑走的太慢，分離效果再好也會影響效率，所以這時候一般會給與壓力，這就是所謂加壓過柱；

• 加壓過柱壓力不宜過高，一般手動的用雙鏈球，自動的就用個養魚泵，兩者都可以如圖改裝一下。
  

前面的內容算一些介紹，下面將以正相柱層析為例子，我們講一下常規的上樣、過柱流程：

1，準備工作要做好

選取柱子時，觀察有無砂板，沒有砂板的柱子記得底部填一些棉花，棉花不宜太厚也不宜太薄，能擋住硅膠不下來就好。這里面涉及到一個比較爭議的問題，即甲醇過柱子會不會溶解硅膠?

菜籽個人的經驗是不會，一個解釋見：

配套的準備好最小極性的的洗脫劑，紫外燈（實驗室個人推薦手提式，隨時可以照一照），加壓設備，以及試管架！

2.選取合適的柱子，加入硅膠，浸潤硅膠，拍平

柱子的選取非常重要，大小應該根據產物的量來計算，一般可以分為：

• 幾毫克的柱子（全合成最終的選擇）；

• 幾十毫克的柱子（方法學擴底物）；

• 500毫克到1克的柱子（方法學做原料）；

• 5~100g左右的柱子，

• 以及更大規模。
  

實驗室最常見柱子直徑和高度比值一般在1:2.5到1:15之間，上樣時硅膠量是樣品量的20～40倍左右。

選取柱子的標準要實際根據你樣品的TLC爬板情況來，如果雜質很多挨得很近，那么盡可能選大一丟丟的柱子，使你的樣品正好能鋪一小薄層（建議厚度在5mm以下），如果雜質很遠，這個厚度自然也可以提高，但也不建議你樣品厚度超過2cm，除非這個產物就是簡單沖一沖就行。

很多人會犯一個錯誤，就是想著我硅膠多加點，加的高高的，我樣品上厚一點是不是也可以分離的很好？

這個答案是否定的！

理由是底下的樣品和上面的樣品不是在同一起跑線，這樣只能的到一部分純的，大部分是交叉的，過不純不說，浪費時間浪費溶劑！

這也是為什么樣品要求鋪薄的原因！

選取柱子后，加入硅膠時可以通過加料漏斗，同時一定要戴上口罩在通風櫥里操作，原因是硅膠吸入人體后無法代謝，會將你的肺部打成篩子。硅膠粉是最毒的粉末之一，矽肺病約占全國塵肺病的50%！

至于浸潤硅膠，推薦的的流程如下：

①先把裝好硅膠的硅膠柱豎直放好，硅膠表面用手拍平，

②硅膠柱底部連接水泵，把硅膠抽實，然后從上面倒入極性最小的洗脫劑，到洗脫劑剛要漏下時，關閉截止閥，防止溶劑抽到水泵。

③在加壓狀態，用最小的展開劑沖七八個柱體積就可以把硅膠浸潤地均一。

3、上樣

上樣分為濕法上樣和干法上樣。

濕法上樣，建議的做法是： 用膠頭吸管吸取樣品，靠近硅膠最上面切面，緩慢均勻滴加樣品，直到覆蓋一層，然后停止加樣，給點壓力讓油狀物沉浸到硅膠層里；油狀物沉浸到硅膠層里后重復這種操作多次，直至全部上完樣！

有些新同學可能好奇為什么這樣操作，而不是一次性把濕法上樣的油狀物一次性上完呢？

答案是這種操作可以減少樣品層的有效高度。 即使還沒有加洗脫劑，但當油狀物浸入硅膠的那一刻，柱層析就已經開始，后面的樣品相當于溶劑在推動前面的樣品在硅膠里吸附、解吸附。

至于干法上樣，除非萬不得已菜籽是不推薦的，固體樣品更推薦打漿或者結晶：

等等。

干法上樣一般會帶來兩個方面的問題；

①拌樣的過程中因為要升溫旋蒸，增加了樣品和硅膠之間反應的可能性；

②干法上樣就意味著樣品層里會引入吸附劑，增加了樣品層高度或柱子的尺寸，需要更多的時間，更多的溶劑。

如果不得已選擇了，拌產物的硅膠用量一般以1~2倍樣品量為宜。其上樣直接把吸附好的粉慢慢倒進柱子就好，一些要求和濕法類似。

4、加入無水硫酸鈉或石英砂

為了避免在加洗脫劑時撞擊到樣品層，使其不均勻，變形，影響分離效率，一般會在樣品層上面鋪一層無水硫酸鈉或者石英砂。

也有見到加棉花的，但是掏出來就有點費勁了。

菜籽個人喜歡鋪無水硫酸鈉，因為它還有干燥的功能，對于二氯甲烷這種易揮發吸熱產生冷凝水的溶劑比較友好！

至于高度多少，就看自己的手法了！

5，梯度洗脫，采樣收集

在上樣之后，菜籽個人喜歡先用小極性溶劑（基本不會讓產物下去的溶劑）沖柱2-3個柱體積，確保上下均一，然后選比例洗脫。

至于過柱子的洗脫劑怎么選？

“洗脫劑的比例是你產物TLC爬板爬到Rf值約0.2時的比例。”

這是菜籽看到很多書中以及很多博主分享的過柱經驗，實際過程中也大差不差，個人來講更喜歡縮小一倍梯度洗脫。

比如如果TLC爬板展開溶劑是PE/EA=2:1，菜籽更可能從PE/EA=4:1開始梯度洗脫，洗脫到PE/EA=2:1結束，一般效果更好。

還有收集洗脫液的時候也是有技巧的，可以先選大一點的試管接收，TLC快到目標點了就換成小一點的試管，這樣可以減少多接一點的可能性，不易包雜。

如果遇到雜質點和產物點挨得比較近的情況，特別是那些熒光又比較弱的，記得不要加壓，應選常壓過柱，每次接半管或更少就換管，也可以提高純化幾率。

6、柱子切忌不要及時處理！

很多新人有個習慣,過柱到了后期，TLC后面一兩管沒有產物，就默認柱子過完了，壓干處理掉。

等到一計算收率才發現收率偏低，或者去打譜發現譜圖不正確，抓錯點了，后悔莫及。

所以菜籽建議您過完想要的點后柱子不要急忙處理，打核磁做收率都匹配之后再處理。

如果忙，或者急著用這根柱子純化其他化合物，建議換大極性良性混合溶劑沖一下，把這部分洗脫液單獨留下來等鑒定結果。

實際上，個人過柱的那些年，在看似出完產物的時候，都會換大極性溶劑沖一沖。遇到過有些東西一開始不了解形狀，實際溶解性很差在柱子上斷斷續續出來，如用純EA確定沖不出來了，但一旦換成二氯甲烷：甲醇體系，還會有！

過柱可能會遇到的一些問題，列如下：

1、洗脫劑和展開劑概念

展開劑是指你TLC爬板時的溶劑比例，洗脫劑是指你過柱時用的溶劑，理論上洗脫劑的極性不應大于展開劑的極性。

但某些特殊不好溶解的產物，過柱后期洗脫劑的極性可能會大些，常用洗脫劑極性以下面順序遞增：

己烷和石油醚 <環己烷<甲苯<二氯甲烷<乙酸乙酯<丙酮<<甲醇<水<乙酸< pan>

至于國外喜歡用的氯仿和乙醚，不建議使用。

2、棉花怎么塞和怎么取的問題

對于沒有砂板的柱子，填棉花有一個小技巧：可以直接拆一個衣架，用其將棉花投進入旋塞上面的出液口

取棉花也有小技巧，在水龍頭上接個軟管，用水壓可以輕易沖出來。

3、柱前樣

過柱之前一定要留柱前樣，特別是比較雜的體系；同時我也建議你過柱前TLC分析時點濃一點，有些雜質太稀的體系看不到！

4、油狀物選擇干法上樣！？

不建議，不建議，不建議！

菜籽看到很多碩士研究生這樣操作，也看到過一些博士研究生這樣操作，當時是懵逼狀態，很不理解。

這得要多少的硅膠才能全部吸附住，本來固體只要1~2倍硅膠吸附，你這樣操作最起碼要十倍以上，也意味著相同柱子，柱效降低10倍以上，甚至遠遠不止！

如果你告訴我是因為產品固不固，液不液才這樣選擇，我會告訴你選方法重結晶試試！

5、用了一次的硅膠可以用大極性溶劑（如甲醇）沖柱處理一下再用嗎？

不建議再使用，塔板數會降低，柱效差，分離效果也差。

舉個最簡單易懂的例子，擦完屁屁的衛生紙，再用你都會疊成兩層，而且兩層的情況下都有可能

“噗”一下弄爛了。

粘一手！

6、硅膠和溶劑會反應嗎？

一般和過柱溶劑不反應，但要注意兩點:

一個是有些溶劑（如二氯甲烷、石油醚） 和硅膠混合的時候會明顯放熱，這也是為什么開始階段有時候試管會發燙的原因，對溫度敏感的化合物要小心；

另一個是甲醇會溶解不純硅膠里的無機鹽，不太建議用純甲醇這種太大極性過柱子！

7、洗脫劑選擇的問題。

洗脫劑一般要根據展開劑比例選，但有時候PE/EA體系TLC不好時，可以用PE/DCM 體系試一試，說不定有更好的效果！

8、grease峰問題

柱子下面的活塞記得一定不要涂硅脂之類的潤滑劑，相似相溶原理，會被淋洗劑帶到產品中從而導致雜峰；如果擔心漏液，建議采用四氟節門的旋塞。

9、干法上樣，樣品怎么準備！

吸附時，一定要旋成粉狀！

吸附時，一定要旋成粉狀！！

吸附時，一定要旋成粉狀！！！

重要的事情說三遍。如果沒有旋成粉狀，成疙瘩顆粒就上樣了，運氣好可能是過不純；運氣不好可能就如同上圖一樣產物在柱子前頭析出來，如果產品溶解性好也就罷了；如果溶解性特別不好，會導致整個柱子每個地方都有產品，即使用甲醇也一直沖不下來，到時候該怎么辦？

分次取出來用大量水洗滌，有機溶劑萃取嗎？

實話告訴你，菜籽這么干過！

效果很差，基本上廢了！

10、吸附強弱問題

硅膠對化合物的吸附性與化合物結構、官能團息息相關 ，一般含有極性較大的基團的化合物與硅膠吸附也越大，下面是根據個人經驗總結的大概排序，可以參考一下：

堿和酸>醇、胺、酰胺、硫醇、酚類>酯、醛、酮>硝基化合物＞芳香族化合物>鹵代物、醚>烯>飽和烴

11、如果發現柱子過雜了或選擇的極性不對

不要勉強也不要猶豫，最正確的做法是：直接換大極性溶劑直接沖下來，重新過柱，以節省時間。

12、柱子有氣泡

無論正相柱還是反相柱，柱子內有氣泡肯定會影響分離效率的。具體處理方法;

一是用洗脫劑反復壓；

二是不加壓狀態下反復拍，氣泡密度影響會往上走。

三，用長的工具投一投，再壓

13、反相柱和正相柱異同

如果過一些極性比較大的化合物如鹽酸鹽、堿性鹽以及含有很多大極性基團的化合物，正相柱就不合適了，此時用到反向柱。

反相硅膠具體就不科普了，但過反相柱有幾點需要科普：

①有反向硅膠自然就有反相硅膠板，一般為鋁板，兩者價格都比較貴，所以要節省使用。

②反向柱體系可以類比HPLC，一般用甲醇-水體系，或乙腈-水體系過柱。過柱極性和正相柱相反，此體系中，甲醇大于水。

③反相柱不適用于全水體系，過完后反相硅膠要用甲醇沖洗干凈，不要壓干，用甲醇浸沒保存

④反相柱也可以干法過柱，但拌樣的的硅膠損壞比較厲害，內部空隙太大有缺陷，建議不要再回收。

14、酸加酸、堿加堿

兩個作用，一個是抑制拖尾；一個是防止分解，特別是堿性化合物如亞胺，由于硅膠是酸性的，一定要小心。

15、選擇合適的固定相

我們都知道用硅膠作固定相過柱子的原理其實是吸附與解吸的平衡。

所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話，就不容易流出，可能導致的后果就是，兩個產物點，極性大的卻更容易出來。

這種情況在有機合成中是經常遇到的。小編也遇到過多次，此時用氧化鋁做固定相可以完美解決！

16、過柱后的產物有些毛毛刺刺的

有些固體過柱后在溶液里TLC時點板是純的，但是旋干點濃一點就會顯現出雜質，相比較再過柱一遍，我更建議你打個漿，溶劑比例選擇比洗脫劑極性小一點。

17、酰氯能不能過柱子？

低級的酰氯肯定不適合，一定會分解；但是高級的固體酰氯還是比較穩定的，可以過柱子，但是我還是建議不要輕易接觸水，畢竟水滴石穿！

相關內容見：

18、硅膠柱能不能停下來過夜？

一般不建議過夜，一方面硅膠是酸性的，可能會導致產物變壞，另一方面，溶劑在硅膠里面是非靜止的的，在截止閥關閉后，無序運動會增大，可能導致產物的平面變得凌亂。

19、柱子一定不要干了！

柱子干了這事比較可怕，柱子干了意味著硅膠里混進了很多氣泡用來填充溶劑缺失的體積，直接導致塔板數降低，分離度降低！

以上，未完待續

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