近期，英國牛津大學(xué)團(tuán)隊(duì)連續(xù)開發(fā)出兩項(xiàng)互補(bǔ)的測(cè)序糾錯(cuò)系列技術(shù)，“同源三聚體標(biāo)記”（測(cè)序后糾錯(cuò)）和“錨固增強(qiáng)”（測(cè)序前糾錯(cuò)）技術(shù)，分別從分子標(biāo)記設(shè)計(jì)和合成源頭兩個(gè)層面出發(fā)，協(xié)同提升單細(xì)胞長讀長測(cè)序的準(zhǔn)確性。

通過擴(kuò)增核苷酸三倍，課題組設(shè)計(jì)了同源三聚體分子標(biāo)記，并開發(fā)了實(shí)驗(yàn)和計(jì)算分析流程。

研究人員從密碼學(xué)汲取靈感，提出了一套適用于同源三聚體分子標(biāo)記的研究體系：

1. 實(shí)驗(yàn)和計(jì)算分析版本（即本次受訪內(nèi)容）；

2. 計(jì)算工具和平臺(tái)（UMIche，目前在審稿中），提供了關(guān)鍵性的測(cè)序性能分析和驗(yàn)證指標(biāo)；

3. 理論推導(dǎo)（預(yù)印版）[3]。

目前，同源三聚體標(biāo)記已發(fā)展成為相對(duì)較全地具有上下游分析配合的測(cè)序技術(shù)方案。

在論文投稿過程中，業(yè)內(nèi)專家點(diǎn)評(píng)稱在單細(xì)胞長讀長測(cè)序和體細(xì)胞變異檢測(cè)中，這項(xiàng)技術(shù)將會(huì)大有可為。并認(rèn)為該團(tuán)隊(duì)使用“通用分子標(biāo)記，CMI”在實(shí)驗(yàn)端做驗(yàn)證的策略，是一種巧妙的點(diǎn)子（ingenious idea）。其還指出在目前的論文中，課題組所提供的糾錯(cuò)場(chǎng)景可能局限了這一方法的潛力，事實(shí)上它能被用于更加復(fù)雜的糾錯(cuò)場(chǎng)景中，例如插入和缺失錯(cuò)誤。

基于這一技術(shù)，該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)辦了一家名為 Entelo Bio（前身為 Caeruleus Genomics）的生物科技公司，希望能夠革新已有的測(cè)序技術(shù)。

目前，本次成果依舊存在生產(chǎn)成本高以及合成偶聯(lián)率低等局限，這讓同源三聚體的量產(chǎn)依舊面臨著不少挑戰(zhàn)。

因此，研究人員正在攜手業(yè)界合作方，探索實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)的可能性。

在計(jì)算上和實(shí)驗(yàn)上，本次技術(shù)的先進(jìn)性均得到了驗(yàn)證。假如可以實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)，它能快速、精確地檢出腫瘤生物標(biāo)志物，也能通過催化方法找到新的藥物分子，并優(yōu)化其結(jié)構(gòu)的速度，并能成為業(yè)界一個(gè)重要且獨(dú)立的商業(yè)運(yùn)行單元。

據(jù)介紹，測(cè)序技術(shù)對(duì)于理解復(fù)雜的生命科學(xué)現(xiàn)象以及闡釋疾病致病機(jī)理是一種重要手段。

測(cè)序時(shí)，通常使用一個(gè)名為“分子唯一標(biāo)記碼”的序列，來標(biāo)記待測(cè)物的身份。

但是，這段序列是隨機(jī)合成，并且也會(huì)出現(xiàn)測(cè)錯(cuò)的情況，所以在測(cè)序之后的糾錯(cuò)就會(huì)變得非常困難。

而本次研究的開展始于一項(xiàng)臨時(shí)實(shí)驗(yàn)的提議。德國慕尼黑工業(yè)大學(xué)博士、英國牛津大學(xué)博士后孫鑒鋒，是本次論文的第一作者。

當(dāng)他剛到牛津大學(xué)報(bào)道的第一天，合作教授亞當(dāng)·克里布斯（Adam P. Cribbs）剛好于同一天刊發(fā)了一篇關(guān)于第三代測(cè)序糾錯(cuò)技術(shù)（scCOLOR-seq）的論文。于是，兩人的不少談話內(nèi)容都涉及到了測(cè)序糾錯(cuò)這一話題。

當(dāng)天，克里布斯教授在身旁的白板上比劃了幾下，寫下幾個(gè)二重和三重同源核苷酸字符，并對(duì)孫鑒鋒說：“我對(duì)量子計(jì)算很感興趣，但是我沒有相關(guān)的理論和計(jì)算背景，這個(gè)項(xiàng)目難度未知，但我覺得實(shí)驗(yàn)上大體可行，數(shù)理計(jì)算是你的專長，你也許可以做出一番不一樣的工作來，要不要試試？”

密碼學(xué)和信息論算是孫鑒鋒本科期間重點(diǎn)專業(yè)課之一，他立刻意識(shí)到克里布斯教授模棱兩可的地方正是著名加密方法“三重冗余模塊”算法擴(kuò)展到非二元系統(tǒng)的應(yīng)用問題，因此他覺得“可以動(dòng)工”。

彼時(shí)，著名的牛津納米孔測(cè)序技術(shù)還沒有迭代到最新版本，平均錯(cuò)誤率依舊高達(dá) 15% 左右，在特定情形下錯(cuò)誤率甚至?xí)该图ぴ觥?/p>

因此，要想在這么高的錯(cuò)誤率之下進(jìn)行糾錯(cuò)，并能實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)測(cè)序著實(shí)讓人望而卻步，在該團(tuán)隊(duì)眼中必須得有“妙手回春”的技術(shù)才行。

通過開發(fā)和驗(yàn)證完整的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法，他們最終有效提升了測(cè)序技術(shù)的精度。

該系列研究的第一項(xiàng)成果“同源三聚體標(biāo)記”技術(shù)的相關(guān)論文以《糾正唯一分子標(biāo)識(shí)符中的 PCR 擴(kuò)增錯(cuò)誤，以生成準(zhǔn)確數(shù)量的測(cè)序分子》（Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules）為題發(fā)在Nature Methods[1]。

圖 | 相關(guān)論文（來源：Nature Methods）

孫鑒鋒是第一作者，牛津大學(xué)教授亞當(dāng)·克里布斯（Adam P. Cribbs）擔(dān)任通訊作者。

圖 | 孫鑒鋒（來源：孫鑒鋒）

在論文被預(yù)接收之時(shí)，Nature Methods編輯團(tuán)隊(duì)表示，打算邀請(qǐng)第三方專家為本次研究額外撰寫一個(gè)評(píng)論并發(fā)表在Nature Methods上。

在那篇評(píng)論文章中，由一名 RNA 測(cè)序精度方面的頂尖專家之一對(duì)本次論文做了簡(jiǎn)評(píng)。

“其實(shí)，在更早之前的審稿階段，他就對(duì)我們的成果持積極態(tài)度。”研究人員表示。另一位業(yè)內(nèi)同行則評(píng)論稱：“該技術(shù)理論層面的可靠性，在其他領(lǐng)域中也已經(jīng)得到了驗(yàn)證和支持”。

研究人員表示，當(dāng)采用逆轉(zhuǎn)錄來合成 RNA 序列的時(shí)候，會(huì)引入一些錯(cuò)誤，而本次測(cè)序技術(shù)解決了這一問題。

在“同源三聚體標(biāo)記”技術(shù)發(fā)表之后，課題組又討論了這樣一個(gè)問題：難道測(cè)序之后的序列錯(cuò)誤，僅僅是在測(cè)序過程中引入的嗎？假如在對(duì)唯一分子標(biāo)識(shí)符進(jìn)行測(cè)序之前出現(xiàn)問題了怎么辦？

這個(gè)問題的產(chǎn)生源自于該研究團(tuán)隊(duì)在一次單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)后對(duì)文庫中分子數(shù)量的異常檢測(cè)：他們觀察到細(xì)胞條形碼的多樣性增多，而分子標(biāo)記（又稱分子條形碼）的多樣性減少。于是，他們懷疑測(cè)序文庫的污染可能跟序列的異常截短或是縮進(jìn)有關(guān)。

針對(duì)這一問題，該團(tuán)隊(duì)又開展了新的研究，借此發(fā)現(xiàn)在測(cè)序之前：由于微珠上多聚核苷酸 T 的縮進(jìn)從而導(dǎo)致分子標(biāo)記被截短，使得微珠上整條序列合成出現(xiàn)問題。

針對(duì)此，他們提出一種名為“錨固增強(qiáng)”的技術(shù)，將一段由 4 個(gè)核苷酸組成的固定序列置于細(xì)胞條形碼和分子標(biāo)記之間，從而有效識(shí)別分子標(biāo)記起始位置。

這個(gè)設(shè)計(jì)方案能夠偵測(cè)到比以往更多的 RNA 分子量，為難以偵測(cè)到罕見病致病基因的問題提供了新的思路和機(jī)遇。

該系列研究的第二項(xiàng)成果“錨固增強(qiáng)”技術(shù)的相關(guān)論文以《利用插入式錨固寡核苷酸序列提升單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析》（Enhancing single-cell transcriptomics using interposed anchor oligonucleotide sequences）為題發(fā)在Communications Biology[2]。

圖 | 相關(guān)論文（來源：Communications Biology）

在后續(xù)計(jì)劃上：

一方面，鑒于本次技術(shù)的可靠性已經(jīng)得到驗(yàn)證，但是距離批量化生產(chǎn)和應(yīng)用還有一定距離，因此他們將嘗試增強(qiáng)合成同源三聚體的效率，以及優(yōu)化其在微珠的附著效率，同時(shí)也會(huì)尋找更多合適的業(yè)界合作伙伴。

另一方面，盡管研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開展過多種計(jì)算分析，但是目前領(lǐng)域內(nèi)依舊沒有系統(tǒng)化的計(jì)算分析方法和平臺(tái)。所以，他們會(huì)持續(xù)開發(fā)新的計(jì)算應(yīng)用方法。

如果以上兩項(xiàng)計(jì)劃都能實(shí)現(xiàn)，這兩項(xiàng)分別用于測(cè)序前和測(cè)序后糾錯(cuò)的系列技術(shù)將有望在揭示罕見病致病機(jī)理上進(jìn)行協(xié)同貢獻(xiàn)，也有望在已有的疾病知識(shí)體系之下挖出新的知識(shí)。

參考資料：

1. Sun, J., Philpott, M., Loi, D. et al. Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules.Nat Methods21, 401–405 (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02168-y

2. Sun, J., Philpott, M., Loi, D. et al. Enhancing single-cell transcriptomics using interposed anchor oligonucleotide sequences.Commun Biol8, 67 (2025). https://doi.org/10.1038/s42003-025-07474-5

3.https://www.researchsquare.com/article/rs-6710367

運(yùn)營/排版：何晨龍