導讀

蛋白糖基化是一種重要的翻譯后修飾，其修飾的蛋白底物范圍和修飾位點由糖基轉(zhuǎn)移酶與受體間的識別決定。酶催化的糖基化定點引入，是獲得均一糖蛋白的重要方法，尤其在N-糖基化研究中已成為有效手段之一。細菌來源的糖基轉(zhuǎn)移酶因其易于表達純化等優(yōu)良性質(zhì)，常被改造為人工合成糖蛋白的工具酶。然而與N-糖基化不同，蛋白質(zhì)O-糖基化通常缺乏嚴格、明確的識別序列，且O-連接糖基化修飾在原核生物與真核生物之間并不保守，細菌O-糖基轉(zhuǎn)移酶在糖基供體和底物識別范圍上與真核生物差距明顯，導致通過細菌糖基轉(zhuǎn)移酶向真核蛋白位點特異性引入O-糖基化修飾面臨挑戰(zhàn)。

2025年7月14日，北京大學化學與分子工程學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心陳興/戴鵬團隊與北京大學生命科學學院、北大-清華生命科學聯(lián)合中心肖俊宇團隊合作，在 Nature Chemical Biology 雜志發(fā)表題為“Protein β-O-glucosylation by Legionella LtpM via short consensus sequons G-T/S and S-G”的研究論文，報道了嗜肺軍團菌效應(yīng)蛋白 LtpM 作為 β-O-葡萄糖基（β-O-Glc）轉(zhuǎn)移酶的性質(zhì)和應(yīng)用。該工作鑒定了 LtpM 的修飾底物，闡明了其通過識別 G-T/S、S-G 序列向許多真核蛋白定點引入 β-O-Glc 修飾的機制。通過 LtpM 這一定點引入 O-糖基化修飾的有力工具，初步揭示了 O-Glc 替代 O-GlcNAc 修飾介導液-液相分離的潛力。

在開發(fā) O-糖基轉(zhuǎn)移酶的過程中，團隊將注意力聚焦在了病原菌效應(yīng)蛋白上，部分效應(yīng)蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，使用真核宿主細胞的糖供體并修真核蛋白底物。在前期發(fā)展的 α-O-Glc 糖基轉(zhuǎn)移酶 SetA 基礎(chǔ)上[1]，進一步開發(fā)了高效、位點特異性引入 β-O-Glc 修飾的新工具。使用帶有生物正交基團修飾的糖供體（尿苷二磷酸-6-疊氮-葡萄糖，UDP-6AzGlc），通過化學酶法策略結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜，鑒定了嗜肺軍團菌效應(yīng)蛋白 LtpM 在細胞裂解液中的修飾底物（圖1）；在853個底物蛋白上鑒定到1176個修飾位點，發(fā)現(xiàn) LtpM 嚴格識別 G-T/S、S-G 序列。核磁共振表征證實 LtpM 催化形成的是 β-O-Glc修飾。通過X射線晶體結(jié)構(gòu)研究、分子模擬與生化表征，團隊探究了 LtpM 的催化機理和對蛋白底物的識別機制。LtpM 糖基供體結(jié)合口袋上方存在 F166、Q167、W228 和K225 四個氨基酸殘基作為門控位點（gatekeepers），形成了狹窄的底物蛋白通道，從而嚴格限定所修飾的絲氨酸/蘇氨酸相鄰殘基必須為甘氨酸這一側(cè)鏈最小的氨基酸。

LtpM 獨特的兩氨基酸識別序列（G-T/S、S-G）使其成為一種有力的糖基化研究工具，在包括天然 Notch 蛋白在內(nèi)的眾多靶蛋白底物上實現(xiàn)了位點特異性 β-O-Glc 標記。對于不符合該識別序列的目標修飾位點，可通過插入或突變單個甘氨酸殘基實現(xiàn)修飾，減少了引入長識別序列帶來潛在蛋白結(jié)構(gòu)干擾。基于對糖基供體底物修飾的容忍性，使用 UDP-6AzGlc 作為糖基供體，LtpM實現(xiàn)了位點特異性地向目標蛋白質(zhì)引入生物正交基團并進一步偶聯(lián)各種功能探針，為生物偶聯(lián)提供了新方法。

圖1. LtpM嚴格識別 G-T/S、S-G 序列實現(xiàn) β-O-Glc 修飾的定點引入。

考慮到 β-O-Glc 修飾與 O-連接的 β-N-乙酰氨基葡萄糖（β-O-GlcNAc）這一重要糖基化修飾的結(jié)構(gòu)相似性，團隊提出 O-Glc 有望作為不被 OGA 水解的 O-GlcNAc 功能替代物（functional surrogate）發(fā)揮作用這一科學假設(shè)，并使用 LtpM 定點引入 O-Glc 加以闡釋驗證。SynGAP 蛋白T1306位的 O-GlcNAc 修飾通過阻斷其與 PSD-95 蛋白的相互作用，抑制兩者液-液相分離過程[2]。通過 LtpM 高效地向 SynGAP T1306位點特異性引入 O-Glc 修飾和相分離表征，揭示了 O-Glc 替代 O-GlcNAc 介導液-液相分離的潛力。

綜上所述，這項研究實現(xiàn)了對軍團菌效應(yīng)蛋白 LtpM 的底物鑒定、酶結(jié)構(gòu)解析和催化識別機理研究，揭示了獨特的兩氨基酸識別序列。該工作為帶有 β-O-Glc 修飾糖蛋白的精準合成和該修飾的功能研究提供了高效的標記新工具。

陳興教授、戴鵬副研究員、肖俊宇教授為該論文的共同通訊作者，李威、高玲、崔世勇和魏田田為共同第一作者。該研究獲科技部、國家自然科學基金、北京分子科學國家研究中心、中國化學會青年人才托舉工程和“科學探索獎”等項目的支持。

https://www.nature.com/articles/s41589-025-01968-3

[1] Gao, L. et al. Legionella effector SetA as a general O-glucosyltrans[2] Lv, P. et al. O-GlcNAcylation modulates liquid–liquid phase separation of SynGAP/PSD-95. Nat. Chem. 14, 831–840 (2022).

來源：北京大學