病毒感染會引起強烈的先天免疫反應，誘導干擾素等細胞因子的表達，進而抑制病毒在細胞內的擴增。cGAS-STING信號傳遞通路是細胞內DNA感應的重要機制，在先天免疫反應過程中起到重要作用。cGAS被DNA激活后，催化合成第二信使環二鳥腺苷酸（cyclic GMP-AMP, cGAMP）。作為cGAS-STING通路下游重要的信息傳遞分子， cGAMP與定位內質網膜的STING分子結合，誘導STING的聚合，進一步激活蛋白激酶TBK1和下游轉錄因子IRF3，誘導干擾素基因的表達。作為第二信使的cGAMP 能否從被感染的細胞輸出，被未感染細胞吸收，與STING結合并誘導干擾素的表達，成為大家比較關注的問題。盡管細胞如何吸收cGAMP 的機理已經得到比較深入的研究，cGAMP如何從被感染細胞運出一直不是十分清楚。西雅圖華盛頓大學醫學院Daniel Stetson實驗室2022年在Immunity發表論文揭示ABC轉運蛋白家族ABCC1能夠從細胞中泵出cGAMP， 抑制cGAS-STING通路的激活，從而抑制依賴cGAS的自身免疫反應。

2025年1月6日，美國德克薩斯農業與工程大學李平衛博士實驗室近期和Daniel Stetson等人合作在Immunity上發表了文章Structures of ATP-binding cassette transporter ABCC1 reveal the molecular basis of cyclic dinucleotide cGAMP export，利用冷凍電鏡技術解析了人源ABCC1 以及它和cGAMP 復合物的分子結構，闡述了cGAMP跨膜轉運機制。

研究人員首先確認了ABCC1參與cGAMP轉運，cGAS和ABCC1 過量表達的細胞外 cGAMP和細胞內cGAMP相比明顯提高，干擾素熒光素reporter的活化明顯降低。然后他們從懸浮培養的293F細胞中純化了人源ABCC1和綠色熒光蛋白的融合蛋白。他們發現大部分ABCC1以二聚體形式存在，只有少量蛋白以單體形式存在。活性測試證實ABCC1二聚體有很強的依賴于cGAMP的ATP酶活性。他們進一步用Split-GFP和激光共聚焦顯微鏡技術證實ABCC1在細胞膜上相互作用，形成二聚體。然后他們用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術解析了ABCC1的3.8 埃分辨率分子結構。很有趣ABCC1形成一個由N末端跨膜結構域 (TMD0) 介導二聚體。第二個ATP結合結構域 (NBD2) 顯示出明顯柔性，沒有明顯的密度（圖一）。為了進一步證實ABCC1二聚體與其cGAMP轉運活性相關，他們突變了參與ABCC1相互作用的氨基酸殘基P1120，這一突變 （P1120F）降低了ABCC1的cGAMP轉運活性以及干擾素熒光素reporter的活化。

圖一：人ABCC1 二聚體的結構

為了弄清ABCC1 轉運cGAMP的分子機制， 研究人員進一步解析了ABCC1與cGAMP復合物的3.54埃分辨率的分子結構，在ABCC1二聚體中的一個ABCC1分子的結合口袋發現明顯的cGAMP 密度 （圖二）。ABCC1通過一個帶正電荷的口袋和一個疏水口袋與cGAMP結合 （圖二）。這個結合口袋大致和另外一種ABCC1底物LTC4的結合口袋重合。與cGAMP的結合似乎影響ABCC1的構象，研究人員利用部分精選數據得到了完整的ABCC1 4.32 埃分辨率的結構。當ABCC1與cGAMP結合后，第二個ATP結合結構域（NBD2）柔性減弱并靠近第一個ATP結合結構域（NBD1），為下一步結合ATP，泵出cGAMP做好準備?；谶@個與cGAMP結合的ABCC1 的結構，研究人員設計了一系列ABCC1的突變體并檢測了他們轉運cGAMP和誘導干擾素熒光素reporter的活性。實驗結果表明突變兩個重要的與cGAMP相互作用的殘基R1197 和R1249都會嚴重影響ABCC1活性。

圖二：ABCC1 與cGAMP復合物的結構，右圖展示cGAMP結合口袋表面電荷分布，藍色表面帶正電荷。

ABCC1轉運cGAMP的最后一個步驟是ABCC1與ATP結合，誘導ABCC1構象變化并將cGAMP釋放到膜外。研究人員試圖解析ABCC1 和ATP 復合物的結構，可惜這一嘗試沒有獲得成功，但是基于牛源ABCC1和ATP復活物的結構，他們建立了人ABCC1與ATP復合物的同源結構模型。和這項工作解析的兩個結構一道，這一系列結構與功能研究揭示了cGAMP從細胞中泵出的分子機制。

北卡羅來納大學教堂山分校張琦博士實驗室在電鏡數據收集和結構解析工作中的重要貢獻，華盛頓大學Daniel Stetson博士實驗室協助進行了ABCC1 KO細胞相關的工作，杰克遜實驗室的Phillip West博士實驗室提供ABCC1激光共聚焦顯微數據，德州農工大學隋學武博士對ABCC1和cGAMP復合物結構解析做出重要貢獻。這項研究工作是李平衛博士實驗室研究生Omkar Shinde 博士論文的核心內容，他對這項研究做出了重要貢獻。

在過去十幾年中李平衛博士團隊對cGAS-STING信號傳遞通路的分子機理進行了深入系統的研究。利用X-射線晶體學和冷凍電鏡技術，他們在2012年就解析了STING 和環二核苷酸c-di-GMP的復合物結構 （Shu et al. NSMB ,2012），2013年他們揭示了cGAS被dsDNA激活的分子機理 （Li et al. Immunity, 2013），2016年他們實驗室揭示了STING招募并活化轉錄因子IRF3的分子機理（Zhao et al. PNAS, 2016), 2019年他們揭示了STING招募和激活蛋白激酶TBK1的分子機制（詳見BioArt報道： ），2020年，他們的研究揭示了cGAS與核小體緊密結合進而被抑制的分子機制（詳見BioArt報道： ）。這一領域還有許多非常有趣的問題值得進一步探索，結構生物學顯然是研究這些問題的強有力手段。

作為先天免疫中的核心的信號傳遞通路，cGAS-STING通路的研究對于理解先天免疫機制、開發新型藥物以及治療自身免疫疾病都具有相當重要意義。通過深入探索cGAS-STING通路如何被激活和被調控，人們可以更好地應對感染、自身免疫性疾病，以及腫瘤等疾病的威脅，為促進人類健康做出重要的貢獻。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.immuni.2024.12.002

本期來源：BioArt