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導讀

曲莖石斛（DF）是一種主要分布在中國中部山區的特有植物，具有重要的藥用和食用價值。在中醫中，DF具有養胃滋陰、清熱的功效。目前，還沒有研究探討曲莖石斛多糖（DFP）對酒精誘導的胃黏膜損傷發揮預保護作用的機制。在這項研究中，DFP（367.478 kDa）是通過水提取和乙醇沉淀提取的，由甘露糖（79.89%）、葡萄糖（19.05%）、木糖（0.42%）、阿拉伯糖（0.33%）和半乳糖（0.31%）組成。我們通過構建酒精性胃黏膜損傷大鼠模型來評價DFP的預保護作用。蘇木精-伊紅染色的組織學分析顯示，DFP緩解了胃黏膜充血和發紅。此外，DFP下調IL-6、IL-1β、MPO和MDA的表達，同時上調PGE2、GSH和SOD的表達。免疫熒光分析表明，DFP上調了ZO-1和Occludin的表達，從而改善了胃屏障功能。多組學分析揭示了其對補體和凝血級聯信號通路以及丙酸代謝通路的調節作用。免疫組織化學分析進一步證實，DFP顯著下調C3、VTN、F2、Serpind1、CPB2、FGA和VWF的表達。總的來說，這項研究為DFP對酒精誘導的胃黏膜損傷的預保護作用和機制提供了新的見解，為開發基于DF的治療資源奠定了基礎。

亮點：

1. 首次從曲莖石斛中提取多糖并對其進行表征；

2. 曲莖石斛多糖（DFP）對酒精誘導的大鼠胃黏膜損傷具有預保護作用；

3. DFP主要調節補體和凝血級聯信號通路以及丙酸代謝通路。

論文ID

原名：Multi-omics analysis reveals the pre-protective mechanism of Dendrobium flexicaule polysaccharide against alcohol-induced gastric mucosal injury

譯名：多組學分析揭示了曲莖石斛多糖對酒精性胃黏膜損傷的預保護機制

期刊：International Journal of Biological Macromolecules

IF：7.7

發表時間：2024.12

通訊作者：劉義飛

通訊作者單位：湖北中醫藥大學

實驗設計

實驗結果

1. DFP的組成和形態特征

DFP主要由總糖、糖醛酸和蛋白質組成，如補充表1所示。用苯酚-硫酸法測定的總糖含量為88.50%±0.89%，糖醛酸和蛋白質含量分別為4.79%±0.23%和3.86%±0.19%。與混合標準品相比，DFP主要含有Ara（0.33%）、Gal（0.31%）、Glc（19.05%）、Xyl（0.42%）和Man（79.89%）（圖1A）。尺寸排阻色譜結合多角度激光散射和折射率檢測（SEC-MALLS-RI）顯示，DFP的數均分子量（Mn）為93.416 kDa，重均分子量為367.478 kDa（補充圖1）。紫外光譜結果顯示，在190至200 nm之間有一個突出的吸收峰，這是多糖的特征，在260 nm和280 nm處有兩個較小的峰，表明存在痕量的蛋白質和核酸（圖1B）。傅里葉變換紅外光譜結果顯示，在3442.10 cm-1處有一個與-OH伸縮振動相對應的強寬峰，在2926.45 cm-1處存在一個C-H伸縮振動峰，在1736.98 cm-1和1636.80 cm-1處出現兩個C=O吸收峰。1433.81 cm-1和1383.99 cm-1處的額外峰對應于C-H彎曲振動，而C-O振動出現在1100 cm-1附近。β-糖苷鍵的特征峰可以在878.73 cm-1處觀察到（圖1C）。掃描電子顯微鏡（SEM）圖像顯示，DFP在低放大倍數下呈蓬松的顆粒狀結構，排列相對松散。在更高的放大倍數下，DFP的結構類似于珊瑚，具有堆疊的形態（圖1D）。

圖1 曲莖石斛多糖（DFP）的特性研究。（A）DFP的單糖組成。（B）DFP的紫外（UV）光譜。（C）DFP的傅里葉變換紅外光譜。（D）DFP的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。

2. DFP對酒精性胃黏膜損傷大鼠UI和器官指標的影響

體內實驗過程如圖2A所示。處死大鼠后，我們收集每組的組織樣本，稱重并拍照。胃組織形態和病理如圖2B所示。對照組胃黏膜形態正常，無明顯病變。相比之下，模型組的胃組織表現出充血、腫脹和其他形式的損傷跡象。陽性和DFP治療組均顯示胃黏膜腫脹和其他病理狀況有所改善。為了進一步評估胃黏膜損傷，我們使用了Guth評分系統。模型組的UI得分最高，而陽性藥組的改善最為顯著，其次是DFP-H組（圖2C）。所有陽性藥組和DFP組均對酒精誘導的胃黏膜損傷具有保護作用。具體來說，陽性藥組的UI抑制率為54.08%±10.25%，DFP-L組的抑制率為31.42%±12.65%，而DFP-H組的抑制效率為44.62%±10.09%。在整個實驗過程中，各組大鼠的體重以相似的增長率增加，沒有顯著差異（圖2D）。此外，各組之間的肝臟、腎臟和脾臟系數沒有顯著差異，表明DFP對大鼠沒有明顯毒性（圖2E）。

圖2 DFP預防酒精性胃黏膜損傷的藥效學實驗。（A）動物實驗程序。（B）胃組織的代表性圖像。（C）各組潰瘍指數（UI）評分。（D）大鼠體重的變化。（E）大鼠肝、腎、脾指數。與對照組相比####P<0.0001，與模型組相比****P<0.0001。

3. DFP對酒精性胃黏膜損傷大鼠的預保護作用

HE染色進一步檢測所有實驗組胃黏膜組織的病理變化。如圖3A所示，對照組胃黏膜細胞組織良好，組織結構清晰，管狀胃腺排列有序。相比之下，模型組表現出明顯的黏膜水腫、血管擴張和出血、腺體結構紊亂和上皮細胞損失。陽性組和DFP治療組均顯示出明顯的改善，特別是在減少黏膜水腫和充血方面。然后我們使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測量大鼠血清中炎性細胞因子IL-6和IL-1β炎性因子的血清水平（圖3B和C）。與對照組相比，模型組顯示這些細胞因子的表達顯著升高，證實了胃黏膜損傷的成功誘導。與模型組相比，陽性組和DFP治療組的IL-6和IL-1β均顯著下調（P<0.05）。髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細胞活化和炎癥的標志物，在酒精暴露后，模型組胃組織中的MPO也升高，反映了炎癥反應的增加。在陽性組和DFP治療組中，其表達顯著降低（圖3D）。前列腺素E2（PGE2）是胃黏膜損傷的保護因子，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）是參與自由基清除的關鍵抗氧化劑，在模型組中表達降低（圖3E-G）。奧美拉唑或DFP給藥導致這些保護因子的表達顯著增加。此外，脂質過氧化的標志物丙二醛（MDA）在模型組中上調，但在DFP或奧美拉唑干預后下調（圖3H）。

圖3 DFP影響炎癥因子和氧化應激因子的表達。（A）HE染色結果。（B-D）IL-6、IL-1β和MPO的表達。（E）PGE2的表達。（F-H）SOD、GSH和MPO的表達。箭頭表示上皮細胞脫落；圓圈表示黏膜充血；三角形表示血管舒張，矩形表示水腫和腺體結構紊亂。與對照組相比，##P<0.01、###P<0.001和####P<0.0001；與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

4. DFP對酒精性胃黏膜損傷大鼠組織蛋白質組學的調控

我們首先進行主成分分析（PCA）以評估各組之間的相關性。如圖4A所示，PCA揭示了模型、DFP-H和對照組之間的明顯分離，DFP-H與對照組緊密地聚集在一起。為了鑒定DFP調節的核心蛋白，我們進行了加權蛋白共表達網絡分析（WPCNA），以探索蛋白質、炎癥因子和氧化應激指標之間的關系。如圖4B所示，棕色模塊與PGE2、SOD和GSH呈顯著正相關，與IL-6、IL-1β、MPO和MDA呈顯著負相關（P<0.05）。相反，紅色模塊表現出相反的相關性模式，盡管這些相關性仍然顯著（P<0.05）。因此，棕色和紅色模塊都被鑒定為由DFP調節的潛在核心蛋白。然后，我們根據|Log2倍數變化|>1.5和P<0.05的標準篩選差異表達的蛋白質。火山圖（圖4C）顯示，與對照組相比，模型組中有406種上調的蛋白質，包括AGT、FGB和SERPIND 1，116種下調的蛋白質。與模型組相比，DFP-H組顯示74種上調蛋白和247種下調蛋白，包括AGT和MASP2（圖4D）。維恩圖進一步確定了紅色模塊的84個共同點和與棕色模塊相關的10個蛋白質（圖4E）。這94種核心蛋白的熱圖顯示在補充圖2中。為了研究蛋白質相互作用（PPIs），我們利用STRING數據庫，并使用Cytoscape 3.9.1將蛋白質分為三個不同的組：綠色、紫色和橙色（圖4F）。綠色簇包含18種差異表達的蛋白質。使用cytoHubba插件，我們通過MCC方法鑒定了前20個核心蛋白（圖4G），圓圈越大，得分越高。大多數核心蛋白聚集在綠色和紫色簇中，如FGB、FGA、SERPIND 1和CPB2。FGB和FGA參與凝血和炎癥，SERPIND1作為凝血抑制劑，CPB2參與纖溶并調節炎癥反應。這些蛋白質與炎癥和凝血密切相關。對94種候選蛋白和前20種差異表達蛋白的KEGG通路富集分析表明，補體和凝血級聯是主要的重疊通路（P<0.05）（圖4H和I）。

圖4 DFP在預防酒精誘導的胃黏膜損傷中的綜合蛋白質組學分析。（A）主成分分析（PCA）結果。（B）WPCNA分析。（C）對照組和模型組之間差異蛋白質的火山圖。（D）模型和DFP-H組之間差異蛋白質的火山圖。（E）Venny圖。（F）由94種蛋白質組成的PPI網絡。（G）來自cytoHubba分析的前20種蛋白質。（H）對照組和模型組的KEGG富集結果。（I）模型和DFP-H組的KEGG富集結果。

5. DFP對酒精性胃黏膜損傷大鼠血清代謝產物的影響

為了闡明DFP對血清代謝物的影響，我們進行了一項廣泛靶向的代謝組學研究。正離子和負離子的總離子色譜圖分別如補充圖3A和B所示。我們采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）來識別各組之間的差異代謝物。如圖5A所示，我們觀察到對照組和模型組之間存在明顯的分離。200次置換檢驗的結果（R2Y=0.999，Q2=0.82）證實了模型的可靠性和預測能力（圖5B）。然后，我們使用VIP>1和P<0.05的閾值鑒定差異代謝物。與對照組相比，我們在模型組中鑒定出147種上調和57種下調的血清代謝物（圖5C）。同樣，圖5D和E顯示，DFP-H和模型組是可區分的，模型具有中等水平的可靠性（R2Y=0.998，Q2=0.433）。與模型組相比，我們在DFP-H組發現26種上調和17種下調的血清代謝物（圖5F）。維恩圖突出顯示了13種差異代謝物，這些代謝物在所有組中表現出一致的表達模式（圖5G）。這13種代謝物在對照組、模型組和DFP-H組中的表達熱圖如圖5H所示，詳細化合物列于補充表2中。通路富集分析確定“丙酸代謝”是與DFP對酒精誘導胃黏膜損傷的保護作用相關的關鍵代謝途徑（圖5I）。前20個靶點和13種差異代謝物之間的相關性分析顯示了很強的相關性（圖5J）。例如，A2M和SERPIND1等關鍵蛋白與甲基丙二酸（MEDN0335）和N-肉豆蔻酰甘氨酸（MEDN1861）等代謝產物顯示出顯著的相關性，進一步驗證了多組學發現。

圖5 DFP對酒精性胃黏膜損傷的預保護作用的血清代謝組學分析。（A）比較對照組和模型組的OPLS-DA圖。（B）對照組和模型組的置換試驗結果。（C）對照組和模型組之間差異代謝物的火山圖。（D）比較模型組和DFP-H組的OPLS-DA圖。（E）模型組和DFP-H組的置換試驗結果。（F）模型組和DFP-H組之間差異代謝物的火山圖。（G）交叉差異代謝物的Venny圖。（H）13種不同代謝物的熱圖。（I）KEGG途徑差異代謝物富集分析。（J）差異代謝物與核心蛋白的相關性分析。

6. DFP對補體和凝血級聯信號通路的影響

一項全面的多組學分析強調了補體和凝血級聯信號通路是DFP對酒精誘導的胃黏膜損傷的預保護作用的關鍵機制。免疫組織化學分析顯示，與對照組相比，模型組中補體C3和VTN的表達升高，DFP處理后表達水平下降（圖6）。此外，我們還檢測了凝血相關因子，包括THRB、Serpind1、FGA、CPB2及其下游蛋白VWF。免疫組織化學進一步證明，DFP顯著下調了胃黏膜損傷大鼠中這些蛋白質的表達（圖6）。PAS染色表明，DFP增加了損傷大鼠胃上皮細胞中粘性物質的分泌（圖7A）。熒光染色結果表明，與模型組相比，DFP顯著增強了胃黏膜中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的熒光強度（圖7B-C）。這些發現表明，DFP增強了對受損胃黏膜的保護作用。

圖6 DFP對酒精誘導的胃黏膜損傷保護作用的關鍵蛋白的免疫組織化學分析

圖7 DFP對胃上皮屏障完整性的影響。（A）胃組織PAS染色。（B）ZO-1和Occludin的免疫熒光分析。（C）ZO-1和Occludin熒光強度的定量。與對照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

隨著生活水平的提高，胃相關疾病的發病率顯著增加。在促成因素中，過量飲酒已成為主要原因。當酒精進入胃時，它會刺激胃黏膜，增加胃酸分泌，破壞黏膜屏障。目前對胃黏膜損傷的理解表明，它主要是由外部侵襲因素和身體內部保護機制之間的不平衡引起的。這突顯了醫療界對能夠保護胃腸道并維持身體穩態的天然化合物的迫切需求。現代藥理學研究強調，多糖具有多種有益活性，包括抗炎和增強免疫作用。鐵皮石斛、金釵石斛和霍山石斛多糖對胃腸道的保護作用已被廣泛研究，表明它們具有減輕胃黏膜損傷的潛力。相比之下，DF是一種主要分布在中國中部山區的特有植物，目前科學界對其成分和藥理作用的研究較少。本研究首次采用多組學技術探討DFP對酒精性胃黏膜損傷的影響及其機制。本研究的工作流程如圖8所示。

圖8 本研究的工作流程圖

本研究進行的藥效學實驗表明，DFP降低了MPO和炎性細胞因子（包括IL-6和IL-1β）的表達。此外，DFP下調了氧化應激標志物（如MDA、GSH和SOD）的表達，同時上調了保護因子PGE2的表達。為了研究DFP對乙醇誘導的胃黏膜損傷的預保護作用的潛在機制，我們使用蛋白質組學來鑒定DFP給藥前后差異表達的蛋白質。鑒于大量差異表達的蛋白質，我們使用WPCNA和蛋白質相互作用分析來進一步鑒定與DFP治療相關的關鍵蛋白質。我們發現棕色和紅色模塊與保護和炎癥因子密切相關。值得注意的是，我們鑒定出20種核心蛋白，包括Sepind1，主要富集在補體和凝血級聯信號通路中。補體系統是先天免疫系統的重要組成部分，由在免疫防御中起關鍵作用的蛋白質組成。C3和C5是該系統的重要組成部分，當發生炎癥反應時，它們會被激活。研究表明，幽門螺桿菌胃炎患者胃上皮細胞中的C3補體激活。DFP干預后，乙醇誘導的胃黏膜損傷大鼠C3和C5的表達顯著降低。?VTN是一種多功能糖蛋白，通過中和MAC自身反應來調節MAC的形成并維持體內平衡。研究表明，VTN/αv整合素可介導小鼠骨髓巨噬細胞NF-κB活化并誘導炎癥因子表達，將VTN表達與炎癥聯系起來。在本研究中，DFP顯著降低了胃黏膜損傷大鼠VTN的表達，從而降低了炎癥反應。

身體的凝血系統包括凝血、抗凝和纖溶系統；保持這三個組成部分之間的動態平衡對于調節血流和防止失血至關重要。在乙醇誘導的大鼠胃黏膜損傷模型中，大量炎癥因子被釋放，導致器官內皮損傷，并導致大量von VWF的釋放。VWF是血小板和內皮細胞之間的關鍵配體，可增強血小板在微循環中的粘附和聚集。此外，CPB2蛋白通過從生物活性肽和蛋白質中去除C末端賴氨酸殘基，在纖溶中起著至關重要的作用。同時，凝血酶原（THRB）的激活加速了凝血酶的產生，并增加了纖維蛋白原FGA的表達。由于穩態失衡，SERPIND1和A2M等抗凝因子持續表達。研究表明，A2M可以直接與IL-1β結合，從而下調NF-kB通路介導的促炎反應。在這項研究中，DFP被證明可以減少大鼠胃組織的充血和發紅。免疫組織化學分析證實，DFP顯著下調C3、VTN和THRB等關鍵蛋白的表達，從而減輕胃黏膜損傷。這項研究首次報道了DFP調節補體和凝血信號通路以預防乙醇誘導的胃黏膜損傷的潛在預保護機制，這與其他石斛屬物種的報道不同。其他研究者發現鐵皮石斛多糖可以改善醋酸誘導的大鼠胃潰瘍。Elisa、qPCR等方法進一步證明鐵皮石斛多糖可以通過減少氧化應激和炎癥反應來改善大鼠胃潰瘍。霍山石斛多糖也被報道能夠通過調節Nrf2信號通路來緩解氧化應激和炎癥，從而改善酒精誘導的大鼠胃黏膜損傷。

多糖是高分子量化合物。研究表明，石斛多糖在胃腸道中被部分消化，大部分未消化的多糖被末端小腸吸收，隨后被腸道微生物群降解為四種促進健康的短鏈脂肪酸。盡管這項研究沒有關注胃腸道菌群，但對DFP胃黏膜損傷有抵抗力的大鼠的血清代謝組學數據在丙酸代謝途徑中得到了富集。該途徑涉及許多不同的代謝產物，如琥珀酸和甲基丙二酸。琥珀酸是TCA的中間體，與各種炎癥性疾病有關。我們在克羅恩病患者中觀察到血清琥珀酸水平升高和SUCNR1表達增加，SUCNR1在小鼠腸道炎癥和纖維化中起著重要作用。因此，調節琥珀酸水平可能有助于維持身體的穩態。甲基丙二酸是丙酸代謝途徑的產物，也是維生素B12缺乏癥的臨床生物標志物，也可以與SUCNR1結合，并與上皮間質轉化、纖維化和炎癥等疾病有關。丙酸是一種重要的SCFA成分，可以在右旋糖酐硫酸鈉結腸炎模型中誘導再生胰島衍生蛋白3型（Reg3）的產生。Reg3-丙酸軸可能對結腸炎期間的腸上皮再生至關重要。丙酸代謝，以及琥珀酸和甲基丙二酸的代謝，在調節炎癥和氧化應激中起著關鍵作用。在酒精誘導的胃黏膜損傷大鼠中，DFP干預前后這些代謝物的顯著變化表明，DFP可能通過調節丙酸代謝提供預保護作用。總之，DFP對酒精誘導的胃黏膜損傷的保護機制涉及多個靶點、途徑和代謝物的調節，它們共同作用修復和加強胃黏膜屏障，同時減少炎癥。這種機制與奧美拉唑形成鮮明對比，奧美拉唑是一種廣泛用于治療胃黏膜損傷的藥物。奧美拉唑主要通過作為質子泵抑制劑抑制胃酸分泌來緩解胃酸誘導的刺激。奧美拉唑通過抑制胃壁細胞中的H+/K+ ATP酶，減少胃酸的產生，從而減輕炎癥并防止進一步的黏膜損傷。此外，通過減少胃酸刺激，奧美拉唑有助于恢復胃黏膜屏障，減少炎癥反應，促進潰瘍愈合。

基于這些結果，我們計劃對這些差異表達的蛋白質和代謝物進行詳細分析，探索DFP通過調節其表達發揮對乙醇誘導的胃黏膜損傷的保護作用。這將有助于我們構建更清晰的DFP核心蛋白核心代謝產物網絡，全面了解DFP對乙醇誘導的胃黏膜損傷的預保護機制。不可否認，這項研究將促進DF的利用，從而促進其種植。

結論

本研究全面探討了DFP對酒精性胃黏膜損傷的預保護作用及其潛在機制。首先，提取并表征DFP，然后進行藥效學實驗，證明其在減少炎癥因子和氧化應激方面的功效，同時緩解酒精誘導的胃黏膜損傷大鼠的胃組織充血、發紅和腫脹。蛋白質組學和WPCNA分析進一步表明，DFP調節補體和凝血級聯信號通路，降低核心蛋白如補體C3、VTN、Serpind1、CPB2和THRB的表達。此外，琥珀酸和甲基丙二酸是DFP給藥前后的關鍵差異代謝物，這些代謝物主要參與丙酸代謝途徑。總之，藥效學、蛋白質組學和代謝組學數據的組合多組學分析為DFP對酒精誘導的胃黏膜損傷的預保護作用和機制提供了重要見解，為DFP資源的保護和未來的應用提供了基礎。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39730050/

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