線粒體是連接氧化應激和成骨細胞死亡的關鍵環節。線粒體不僅負責產生ROS（氧化應激的重要貢獻者），還具有內在的抗氧化系統來平衡ROS和維持細胞氧化還原平衡。然而，長期暴露于氧化應激會損害線粒體穩態，損害其維持充分抗氧化防御的能力。因此，ROS的過度釋放進一步放大了細胞氧化應激，建立了一個有害的循環。此外，線粒體在調節細胞死亡信號通路和蛋白表達方面發揮著至關重要的作用，使線粒體損傷能夠激活多種細胞死亡途徑，如線粒體自噬和鐵死亡。幾項研究探討了gcs誘導的氧化應激、線粒體功能障礙和隨后的成骨細胞死亡之間的關系。這些研究探討了GCs如何誘導氧化應激，導致線粒體損傷并最終導致成骨細胞死亡。因此，靶向線粒體可能是減輕gcs誘導的氧化應激觸發的成骨細胞死亡的關鍵。

2025年1月26日，廣州中醫藥大學陳鎮秋/何偉團隊在Bone Res（IF=14.3,醫學1區）上在線發表題為“ Isovitexin targets SIRT3 to prevent steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by modulating mitophagy-mediated ferroptosis ”的文章，揭示了異牡荊素對激素性股骨頭壞死的影響和分子機制，Isovitexin通過促進SIRT3的表達，有效地調節線粒體自噬，維持成骨細胞中的線粒體穩態，抑制鐵死亡，恢復成骨能力。

摘要

糖皮質激素（glucocorticoid， GC）介導的氧化應激誘導的成骨細胞死亡在激素性股骨頭壞死（steroid-induced osteonecrosis of The femoral head， SIONFH）的發生發展中起著至關重要的作用。由成骨細胞驅動的骨形成改善在SIONFH的預后中顯示出良好的結果。異牡荊素已被證明具有抗氧化特性，但其對gc誘導的氧化應激和SIONFH的治療作用尚不清楚。在這項研究中，我們使用蛋白質組學和生物信息學方法分析了從SIONFH患者獲得的臨床樣本。我們發現線粒體穩態失衡和鐵死亡誘導的成骨能力受損在SIONFH中。隨后，我們研究了線粒體與鐵死亡之間的因果關系，以及線粒體自噬在維持線粒體穩態和控制鐵死亡中的調控作用。然后，我們確定了SIRT3在調節線粒體穩態和鐵死亡中的關鍵作用。此外，分子對接和免疫共沉淀證實SIRT3和BNIP3之間存在強相互作用。值得注意的是，恢復SIRT3表達顯著抑制了BNIP3/NIX通路介導的病理性線粒體自噬。此外，我們發現Isovitexin通過促進SIRT3的表達，有效地調節線粒體自噬，維持成骨細胞中的線粒體穩態，抑制鐵死亡，恢復成骨能力，從而顯著改善SIONFH。這些發現揭示了異牡荊素對SIONFH的作用和分子機制，并強調靶向SIRT3作為抑制成骨細胞線粒體自噬介導的鐵死亡和抗SIONFH的潛在策略。

1.線粒體穩態的破壞和鐵死亡誘導的成骨能力的損傷在SIONFH中存在

為了研究股骨頭壞死的潛在機制，我們對股骨頭壞死區域和健康區域的骨片進行了蛋白質組學分析。對所得數據進行全面的生物信息學分析。首先，我們進行了差異蛋白質分析，以確定上調或下調的蛋白質（圖1a）。隨后進行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集分析發現線粒體和氧化應激相關的生物過程顯著參與（圖1b）。在KEGG富集分析中，鐵死亡通路因其與氧化應激和線粒體的復雜關聯而受到特別關注（圖1c）。

為了驗證這些發現，我們進行了體內和體外實驗。在體內實驗中，我們建立了大鼠SIONFH模型來驗證觀察結果，而在體外實驗中，我們使用MC3T3-E1細胞干預GCs對成骨細胞的作用。大鼠股骨頭IF染色顯示ROS水平顯著增加，線粒體自噬相關標志物BNIP3/NIX病理性升高（圖1d， e）。在MC3T3-E1細胞中DEX干預后，觀察到ATP釋放減少（圖1f）和MMP丟失（圖1g），表明線粒體損傷。TEM進一步證實了DEX干預后MC3T3-E1細胞線粒體中存在線粒體自噬（圖1h）。流式細胞術分析顯示，DEX處理后，ROS水平升高，通過平均熒光強度（MFI）測量（圖1i）。此外，通過IF分析（圖1j）和WB分析（圖1k）檢測線粒體自噬（BNIP3/NIX）、分裂（DRP1）和融合（MFN1/MFN2）的標志物。結果表明，線粒體自噬和分裂增強，而線粒體融合減少。

圖1 在SIONFH中線粒體穩態被破壞

我們已經將后續與線粒體自噬相關的實驗的重點轉移到BNIP3/NIX通路。此外，免疫組織化學染色顯示，在SIONFH大鼠股骨頭中GPX4的表達顯著降低（圖2a）。體外WB（圖2b）、IF染色（圖2c）、MDA水平、Fe2+水平和GSH水平的測定（圖2d）進一步證實了鐵死亡的存在。最后，OCN的IHC染色表明，在SIONFH大鼠的股骨頭內，成骨能力減弱（圖2e）。包括qRT-PCR（圖S1G）、WB分析（圖2f）和ALP染色（圖2g）在內的體外實驗為成骨能力下降提供了額外的支持。

圖2 在SIONFH中存在鐵死亡誘導的成骨能力受損

2.恢復線粒體穩態可以挽救MC3T3-E1細胞的成骨能力，防止鐵死亡

首先，確定XJB-5-131的合適干預濃度，將細胞分為3組：對照組、地塞米松組、地塞米松+ XJB-5-131組。采用CCK-8法評估XJB-5-131對MC3T3-E1細胞的毒性（圖3a），確定干預濃度為800 nmol/L。我們最初的重點是XJB-5-131對線粒體穩態的修復作用。通過JC-1染色（圖3b）、ROS的流式細胞術分析（圖3f），我們觀察到XJB-5-131干預導致MC3T3-E1細胞中MMP恢復、ATP釋放增加和ROS水平降低。此外，我們使用TEM檢查線粒體形態（圖3c），并使用WB（圖3d）和IF染色（圖3e）對線粒體自噬、分裂和融合標志物進行定量分析。結果表明，與DEX組相比，XJB-5-131處理減少了線粒體自噬和分裂，同時促進了線粒體融合。為了驗證恢復線粒體穩態是否會抑制鐵死亡，我們進行了IF染色（圖3g）和WB分析（圖3h），并測定了MDA、Fe2+和還原性GSH的水平（圖3I）。這些測量和分析表明，線粒體調控在鐵死亡的發生中起著至關重要的作用。最后，我們通過ALP染色（圖3j）、WB（圖3k）檢測了XJB-5-131對成骨分化的修復作用。結果顯示，與DEX組相比，DEX + XJB-5-131組的成骨能力得到了恢復。

圖3 恢復線粒體穩態可以挽救MC3T3-E1細胞的成骨能力，防止鐵死亡

3.線粒體自噬在維持MC3T3-E1細胞線粒體穩態中起關鍵作用

通過CCK-8實驗確定Mdivi-1的安全濃度后，我們選擇5 μmol/L作為干預濃度（圖4a）。首先，使用TEM（圖4b），我們觀察到Mdivi-1干預后dex誘導的線粒體自噬被抑制。WB（圖4d）和IF染色（圖4e）結果也表明，與DEX組相比，線粒體自噬受到抑制，線粒體分裂減少，線粒體融合增加。MMP恢復（圖4c）和ROS水平降低（圖4f）進一步證實了線粒體自噬在調節線粒體穩態中的關鍵作用。隨后，我們驗證了Mdivi-1對鐵死亡的抑制作用。WB分析（圖4g）和IF染色（圖4h），以及MDA、Fe2+和GSH水平的測定（圖4i）表明，鐵死亡的發生從根本上受到線粒體自噬的調節。最后，我們通過ALP染色（圖4j）、WB（圖4k）檢測了Mdivi-1對成骨分化的修復作用。結果顯示，與DEX組相比，DEX+Mdivi-1組的成骨能力有所恢復。這些發現表明鐵死亡的發生依賴于線粒體自噬，而線粒體自噬在維持線粒體穩定性中起著至關重要的作用。抑制過度線粒體自噬可保護MC3T3-E1細胞免于鐵死亡，恢復其促進骨形成的能力。

圖4 線粒體自噬在維持MC3T3-E1細胞線粒體穩態中起關鍵作用

4.SIRT3通過調控線粒體自噬發揮其調控作用

我們首先從公共數據中選擇鐵死亡和線粒體相關蛋白，將其與從SIONFH患者骨片中獲得的差異表達蛋白取交集，共得到45個蛋白，均來源于患者樣本。最后，我們通過三種機器學習技術確定了關鍵蛋白SIRT3（圖5a）。蛋白質組學分析發現SIRT3表達下調，WB（圖5b）和IF染色分析（圖5c）進一步證實了GCs干預后SIRT3表達下調。鑒于線粒體自噬在維持線粒體穩態中的重要作用，我們假設SIRT3可能通過調節線粒體自噬發揮其作用。為了研究這一點，我們在SIRT3和BNIP3之間進行了分子對接，發現這兩個蛋白之間有很強的結合親和力（圖5d）。隨后，我們進行Co-IP實驗進一步證實SIRT3與BNIP3的相互作用（圖5e）。由于DEX治療導致SIRT3表達的抑制，我們的目的是通過使用SIRT3激動劑來驗證我們的假設。

圖5 SIRT3通過調控線粒體自噬發揮其調控作用

通過前期實驗確定SIRT3激動劑的安全濃度后，我們以800 μmol/L的濃度進行實驗（圖5f）。首先，我們使用TEM（圖5g）、IF染色（圖5h）和WB（圖5i）驗證了SIRT3激動劑對線粒體自噬的調節。結果表明，SIRT3激動劑增加SIRT3表達，抑制線粒體自噬和線粒體分裂，促進線粒體融合。ROS的流式細胞術分析（圖5j）和JC-1染色（圖5k）表明，SIRT3激動劑修復了dex誘導的線粒體功能損傷。隨后，我們驗證了SIRT3激動劑對鐵死亡的抑制作用（圖6a-c）及其在恢復成骨分化中的作用（圖6d、e）。綜上所述，這些實驗結果支持SIRT3通過調節線粒體自噬恢復線粒體穩態，從而抑制MC3T3-E1細胞鐵死亡，促進成骨分化的結論

圖6 SIRT3通過調控線粒體自噬抑制鐵死亡，恢復成骨能力

5.異牡荊素通過上調SIRT3恢復gcs誘導的線粒體損傷

在體外實驗的最后一步，我們對Isovitexin和SIRT3進行了分子對接（圖7a），并進行了網絡藥理學分析，以研究Isovitexin和SIONFH之間的關聯。結果表明，異牡荊素不僅表現出與SIRT3的強結合親和力（- 8.1 kcal/mol），而且主要靶向與SIONFH相關的氧化應激和線粒體。我們確定Isovitexin的安全濃度為150 μmol/L，并繼續驗證其對SIRT3的調節作用。通過IF染色（圖7b）、WB（圖7c）和TEM（圖7d），我們證實了Isovitexin通過激活SIRT3增加SIRT3的表達，促進線粒體融合，抑制線粒體自噬和分裂。JC-1染色（圖7e）和ROS的流式細胞術分析（圖7f）進行的進一步評估闡明了Isovitexin對線粒體功能的恢復作用。與之前的實驗類似，我們也證實了Isovitexin對鐵死亡的抑制作用（圖7g， h）以及其恢復成骨分化的能力（圖7i， j）。這部分實驗的結果證實了Isovitexin通過上調SIRT3來恢復gcs誘導的線粒體損傷并預防MC3T3-E1細胞的鐵死亡。異牡荊素激活SIRT3，促進線粒體融合，抑制線粒體自噬和分裂，恢復線粒體功能。

圖7 異牡荊素通過上調SIRT3恢復gcs誘導的線粒體損傷

6.異牡荊素靶向SIRT3通過調控線粒體自噬介導的鐵死亡來預防SIONFH

首先進行HE染色評估模型誘導成功；結果顯示實驗組空骨陷窩增多，表明存在SIONFH。然而，藥物組顯示出較低的空陷窩，表明藥物對SIONFH大鼠的治療效果（圖8a）。Micro CT結果顯示BV/TV、Tb。N和Tb。實驗組的Th值最低，而藥物組的上述指標均有明顯改善。另一方面，Tb。藥物組的Sp高于實驗組，與預期結果一致（圖8b， c）。接下來，使用IHC染色（圖8d， e）和WB（圖8f）分析各組成骨標志物的表達。結果顯示，雖然在藥物組中RUNX2和OCN的表達沒有對照組高，但與實驗組相比，它們顯著增加。

圖8 異牡荊素通過促進成骨來對抗SIONFH

此外，為了驗證體外實驗中提到的機制，我們檢測了線粒體相關指標。IF染色顯示，所有4個藥物組的ROS表達均降低（圖9a）。進一步的IF染色和WB分析結果顯示，與實驗組相比，SIRT3在XJB-5-131和Mdivi-1組中表達沒有變化，而在SIRT3激動劑和Isovitexin組中表達增加，這與體外實驗的結果一致（圖9a， b）。IF染色和WB分析還檢測了關鍵標志物如BNIP3， NIX, MFN1， MFN2和DRP1的表達。結果表明，實驗組線粒體自噬和分裂增強，而融合減少。然而，四個藥物組能夠逆轉這一情況，并恢復線粒體穩態（圖9a， b）。最后觀察鐵死亡相關指標。IHC染色（圖9c、d）、MDA檢測（圖9e）、GSH檢測（圖9f）、WB分析（圖9g）結果顯示，實驗組發生了明顯的鐵死亡，而藥物組有效抑制了鐵死亡。

綜上所述，基于這部分動物實驗，我們最終可以得出結論，Isovitexin靶向SIRT3通過調控線粒體自噬抑制成骨細胞鐵死亡來預防SIONFH。結果支持異牡荊苷預防SIONFH的潛力。

圖9 異牡荊素靶向SIRT3通過調控線粒體自噬介導的鐵死亡來預防SIONFH

結論

綜上所述，我們的研究表明，異牡荊素對SIONFH的作用依賴于SIRT3。總之，異牡荊素上調SIRT3，抑制過度線粒體自噬，恢復GCs誘導的氧化應激導致的線粒體穩態失衡，從而減少成骨細胞的鐵死亡。綜上所述，我們的研究揭示了SIRT3在調節線粒體自噬和維持線粒體穩態中的重要作用。此外，我們的發現強調了靶向SIRT3抑制成骨細胞線粒體自噬介導的鐵死亡以對抗SIONFH的前景。

Fan Y, Chen Z, Wang H, Jiang M, Lu H, Wei Y, Hu Y, Mo L, Liu Y, Zhou C, He W, Chen Z. Isovitexin targets SIRT3 to prevent steroid-induced osteonecrosis of the femoral head by modulating mitophagy-mediated ferroptosis. Bone Res. 2025 Jan 26;13(1):18. doi: 10.1038/s41413-024-00390-0.

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