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引言：mRNA疫苗的崛起

新型冠狀病毒（COVID-19）大爆發以來，mRNA疫苗以前所未有的速度進入公眾視野，它的神秘面紗也迅速被揭開。簡單地說，mRNA疫苗就是在確定了病原體的抗原后，將抗原蛋白質的mRNA序列合成出來，再用合適的遞送系統如脂質體納米顆粒（LNP）將其封裝，形成的LNP/mRNA顆粒通過注射進入體內，然后穿過細胞的磷脂雙分子層，釋放出mRNA進行翻譯表達抗原蛋白質，激活適當的免疫反應，從而起到預防作用。

mRNA疫苗生產具有很強的平臺性，一旦平臺搭建好，迅速開發不同的mRNA疫苗產品就比較容易。Moderna和Pfizer/BioNTech可以在短時間內開發出多個mRNA產品，就是個很好的證明。從目前的研究數據來看，一個有潛力的遞送系統可以安全有效地遞送多個mRNA序列，也就是說，開發不同傳染病的mRNA疫苗產品，重點是抗原及mRNA序列的確定。

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抗原：疫苗設計的基石

針對不同的病原體開發mRNA疫苗時，首先需要確定的是靶點（即可誘導免疫保護作用的抗原蛋白質），有些病原體的抗原已經比較明確，比如COVID-19主要是病毒表面的刺突蛋白（spike，S蛋白），呼吸道合胞病毒（RSV）主要是融合前構象的融合蛋白（pre-fusion，pre-F蛋白），水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）主要是一種表面糖蛋白分子gE。

目前主要的商業化mRNA疫苗就是針對這些病原體開發的，因此，目前國內外針對已經確定的抗原進行迭代優化的研究經驗比較豐富；而有些病原體，確定抗原本身就是一個難題，比如肺結核、瘧疾，對于開發mRNA疫苗產品來說就有更長的路要走。

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抗原的優化：從自然到卓越的升級

對于mRNA疫苗來說，對抗原蛋白質優化的過程是不斷提高產品安全性和免疫保護作用的過程，優化策略包括氨基酸突變、蛋白質部分功能區域優化、穩定蛋白質聚集體的改造等。蛋白質功能區域的優化和穩定蛋白質聚集體的改造，包括：信號肽序列優化、跨膜結構域優化、細胞內序列優化、蛋白質三聚體化元件的加入等。鑒于目前國內外對抗原進行迭代優化的研究經驗比較豐富，我們在此主要盤點的是已經商品化的mRNA疫苗的抗原優化經驗，以供學習和借鑒。

用于預防COVID-19的mRNA疫苗是目前接種人群最廣的mRNA疫苗，此疫苗的開發過程更是積累了很多比較成功的抗原優化策略。COVID-19表面的刺突蛋白（spike，S蛋白）是病毒感染后中和抗體的主要靶標，也是疫苗設計的主要靶點。針對S蛋白的優化，首先是S-2P突變，S蛋白的融合前構象是激活免疫反應的活躍構象，S-2P突變（S蛋白上第986和987位氨基酸突變為脯氨酸，即 K986P/V987P）可以將S蛋白穩定在活躍狀態，增強S蛋白抗原的免疫藥效，Moderna和Pfizer/BioNTech的mRNA疫苗均使用了S-2P突變。其次是嘗試截短S蛋白，S蛋白上的受體結合域（receptor-bingding domain，RBD）是S蛋白的核心功能區域，既是S蛋白中直接與宿主細胞受體結合的區域，又是中和抗體的主要靶標，因此，研究者嘗試直接利用RBD序列作為抗原序列。BioNTech的研究發現，RBD序列和S蛋白的mRNA/LNP制劑在動物模型和人體中都可以誘導良好的免疫反應，然而相比S蛋白的mRNA/LNP制劑，RBD序列的mRNA/LNP制劑在人體中的耐受性相對較差，比如相同劑量下，RBD序列的mRNA/LNP制劑引起更嚴重的注射部位疼痛、發紅和腫脹，發熱、疲勞和風寒的發生率也相對較高，這也是BNT最終選擇全長S蛋白作為抗原序列的主要研究證據。

Moderna開發的用于預防呼吸道合胞病毒（RSV）的mRNA疫苗是繼COVID-19 mRNA疫苗以后的又一款已經商業化生產并被廣泛接種的疫苗。在抗原設計上，Moderna針對 RSV的主要抗原蛋白——融合前構象的融合蛋白（pre-fusion，pre-F蛋白）的優化改造是經歷了迭代更新的。它的第一代產品是與Merck合作開發的mRNA-1777（即2020年發表在npj vaccine 文章中的mDS-Cav1），主要優化策略是通過4個氨基酸突變（S155C、S290C、S190F和V207L）將F蛋白穩定在融合前構象，即pre-F蛋白。它的第二代產品也是商品化產品——mRNA-1345，是在mRNA-1777基礎上增加2個突變位點（A149C和Y458C），并且去掉了104-144氨基酸殘基（包含p27和fusion peptide）用GS連接子替換，另外，去掉了細胞質內序列。它的動物模型研究數據和臨床試驗研究數據均顯示，mRNA-1345誘導的免疫保護作用顯著優于mRNA-1777，由此可見，抗原優化的重要性和必要性。

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新抗原的設計和選擇：突破傳統疫苗開發的局限

一些傳染性疾病，例如瘧疾、艾滋病、幽門螺旋桿菌、耐藥性金黃色葡萄球菌等，從病原體發現到現在已有一段時間，但依然沒有可用疫苗；一些傳染性疾病如結核分枝桿菌等，目前雖然有可用疫苗但保護作用有進一步提升空間；還有一些傳染性疾病如流感病毒，毒株突變速度快，而開發傳統疫苗又比較費時；mRNA制劑科學和技術的發展為這些疾病的疫苗開發和優化提供了新的方向。針對這些傳染性疾病開發mRNA疫苗，首先要進行新抗原的挖掘、研究和確定，目前已有不少研究者和企業在做這方面的工作，研究方法也比較多樣化。

據WHO統計，全球約四分之一的人口感染有結核桿菌，大約5%至10%的感染者最終會出現癥狀并發展為結核病，2023年總共有125萬人死于結核病，可能是全球由單一傳染性病原體導致死亡的首要原因。目前，卡介苗（BCG）是唯一獲批用于預防結核病的疫苗，然而，卡介苗在嬰兒出生時接種，隨著年齡增長其產生的免疫力逐漸衰減，因此在成年人群中的保護效果存在較大差異；此外，一部分人群因先天免疫抑制或遺傳因素導致接種后保護力不足。因此，開發新的結核病疫苗依然是研究人員努力的方向，也是政策資金著重支持發展的方向。

BioNTech的研究人員在成功開發COVID-19 mRNA疫苗后，開始進行結核病mRNA疫苗的研究。通過查閱BioNTech的專利發現，研究者進行了廣泛而深入的文獻調研，根據以往的研究數據及疫苗開發經驗，選擇了8個候選抗原（Ag85A、M72、ESAT6、RpfA、RpfD、Hrp1、VapB47和HbhA）嘗試了嘗試了一些優化設計，分別是：

1）抗原的組合形式，比較一個mRNA只包含單個抗原或者一個mRNA包含多個抗原的組合，發現一個mRNA只包含單個抗原的免疫激活效果更好；

2）嘗試了不同信號肽融合抗原后誘導的免疫反應，認為人HLA-I信號肽效果最好；

3）綜合各種因素，最后詳細評價了一個RNA混合物，包含4個mRNA承載8個抗原（每個mRNA包含2個抗原編碼信息）誘導的免疫效果，推測這個組合是最優的抗原組合。

目前BioNTech開發的結核病mRNA疫苗處在臨床研究階段，還沒有更多的研究數據公開，但是它對多抗原mRNA疫苗的探索和嘗試過程值得我們借鑒學習。

隨著人工智能的迅速發展以及大規模免疫組庫和免疫肽組學數據集的生成，新抗原設計也走上了快車道。機器學習計算技術結合大型免疫學數據集，可以指導和優化疫苗靶點預測方法以提高預測的準確性，主要涉及B細胞和T細胞表位的預測以及表位-互補位相互作用的預測等。Evaxion公司正在借助人工智能開發針對金黃色葡萄球菌的多組分預防性疫苗。據說該疫苗靶向多種毒力因子和毒素，并涵蓋多種菌株。目前該疫苗已通過計算機模擬分析和臨床前研究（包括致死性膿毒癥和皮膚膿腫感染模型）驗證，正在開發中，期望用于預防皮膚和軟組織感染，以及治療其他金黃色葡萄球菌感染。

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全鏈條開發：從抗原到疫苗

對于mRNA疫苗開發來說，抗原的設計與優化是第一步，也是最為關鍵的一步。不同病原體的抗原，作用機制千差萬別，表現出的免疫保護作用也各不相同，機體對其耐受性也不盡相同，因此針對不同病原體設計mRNA疫苗時，首先要研究的問題就是抗原的安全性和免疫藥效。另外，mRNA序列本身也對mRNA制劑的安全性和免疫藥效有影響，如何優化mRNA序列就是另外一個話題了，我們將在后續的推文里詳細闡述。

當然，如果自主開發遞送系統，就需要做更多的工作。首先是新化合物的設計與合成，設計的化合物組裝成LNP后要求安全性良好、遞送效率良好，有規模化生產的可及性（即化合物本身化學性質穩定，易于規模化生產，易于儲存）。其次，LNP配方優化、緩沖體系優化、保存條件等也需要做進一步研究與確定。不同遞送系統對機體的免疫刺激作用不同，開發新的LNP系統時，還要結合抗原mRNA評價它的安全性和有效性。這個話題，我們也會在后續的推文里詳細闡述。

針對不同的研究問題，通過合理的實驗設計，我們可以獲得有價值的關鍵實驗結果。現在將這些科研問題清單總結如下，以供參考學習。

mRNA疫苗早期開發階段問題清單

早期研

究階段

研究的問題

有價值的關鍵結果

涉及的主要實驗活動

針對mRNA序列

新抗原設計（針對無疫苗可用或疫苗有待優化的傳染性疾病）

篩選的抗原免疫原性良好，安全性良好

抗原設計（結合AI）、蛋白質結構確認、蛋白質表達及確認、免疫原性評價、安全性評價(急性毒性評價）

抗原優化（蛋白質突變、信號肽序列優化、跨膜結構域優化，細胞內序列優化等）

優化條件可以改善抗原表達或抗原免疫原性，或者可以改善安全性

蛋白質表達及確認、免疫原性評價、安全性評價(急性毒性評價）

mRNA序列優化（UTR序列優化、mRNA二級結構優化）

優化條件可以改善抗原表達或抗原免疫原性，或者可以改善安全性

蛋白質表達及確認、免疫原性評價、安全性評價(急性毒性評價）

針對LNP遞送系統

新化合物設計與合成

化學性質穩定，純度符合要求的化合物

化學合成、化合物質量屬性檢測、化合物純度檢測

LNP配方優化、緩沖體系優化（注意要結合中試工藝可行性進行）

LNP配方合理，包封的抗原mRNA體內體外表達良好，安全性良好

LNP配方設計與包封、關鍵質量屬性檢測、體內外遞送效率（生物活性）評價、包封特定抗原mRNA序列后免疫原性評價和安全性評價(急性毒性評價）

LNP保存條件優化（包括凍干工藝優化、凍干緩沖液體系優化，注意要結合中試工藝可行性進行）

LNP儲存穩定性良好（不同保存時期LNP微觀結構、理化檢測指標、生物活性相對穩定）

LNP檢測（包括LNP微觀結構和理化檢測指標）、體內外遞送效率（生物活性）評價、包封特定抗原mRNA序列后免疫原性評價和安全性評價(急性毒性評價）

總之，在mRNA疫苗的早期開發階段，除了抗原蛋白質的選擇與優化之外，還有很多其他問題需要研究確定，這些問題有點類似星星，多而散，但是這些問題一旦獲得積極的結果，星星之火便能呈燎原之勢。

參考文獻

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2. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation.

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6. BNT162b vaccines protect rhesus macaques from SARS-CoV-2.

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8. Design and preclinical assessment of mRNA-1345 prefusion F glycoprotein-encoding mRNA vaccine 1 for respiratory syncytial virus.

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12. An mRNA Vaccine for Herpes Zoster and Its Efficacy Evaluation in Na?ve/Primed Murine Models

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撰寫| 中生復諾健

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設計| Alice