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Introduction

尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）是僅次于鯉魚的第二大養(yǎng)殖魚類，占全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的8%。基因改良的養(yǎng)殖羅非魚（GIFT）是一種具有改良遺傳特性的尼羅羅非魚品種，它是從尼羅羅非魚培育出來的。這種物種有更快的生長速度，更高的身體，更厚的背部，以及穩(wěn)定的遺傳特征，并接受補(bǔ)充飼料。由于其豐富的營養(yǎng)、良好的口感和風(fēng)味，GIFT已成為中國重要的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。

幾種飼料添加劑已被用于GIFT養(yǎng)殖。特別是乙氧基喹啉（EQ）是一種廣泛使用的常見飼料添加劑，它是一種具有清除脂質(zhì)過氧化自由基能力的芳香胺。EQ能有效防止飼料中脂肪和蛋白質(zhì)成分在貯存過程中的氧化。此外，EQ還通過防止過氧化物的形成來保護(hù)飼料中的VA和VE。然而，一些研究表明，EQ對動(dòng)物有有害影響，可能會(huì)導(dǎo)致體質(zhì)量減輕、代謝失衡、免疫紊亂，甚至增加死亡率，而IC50斑馬魚和羅非魚的EQ范圍從10到20 mg/L。由于缺乏對動(dòng)物、消費(fèi)者和環(huán)境安全性的評估數(shù)據(jù)，歐盟禁止在飼料中應(yīng)用EQ（歐盟法規(guī)2017/962），但EQ在全球大多數(shù)國家仍被廣泛使用，其確切危害尚不清楚。除了影響?zhàn)B殖動(dòng)物外，動(dòng)物組織中的EQ殘留還可能直接影響消費(fèi)者的健康，受EQ影響的動(dòng)物可能通過生產(chǎn)不健康的產(chǎn)品間接危害人體。據(jù)報(bào)道，EQ在水產(chǎn)品和家禽中的殘留濃度分別為0.14～24.20 μg/kg和15～238 μg/kg。

據(jù)報(bào)道，EQ對人類淋巴細(xì)胞有毒性作用，并能在人類淋巴細(xì)胞中引起DNA損傷。此外，EQ可能會(huì)調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動(dòng)物的腸道微生物群和代謝物，而改變的微生物和代謝物可能會(huì)轉(zhuǎn)移到消費(fèi)者，從而引起二次生物危害。

微生物群包括各種微生物（細(xì)菌、真菌、古菌、病毒和原生動(dòng)物）群落，它們定植在宿主組織中，代表一種重要的酶資源，對食物的消化和吸收有顯著的貢獻(xiàn)。胃腸道中的高微生物多樣性水平對宿主營養(yǎng)、生長和發(fā)育至關(guān)重要。然而，微生物群中的細(xì)菌是魚類中大多數(shù)能夠引起人類食源性疾病病原體的代表。

飼料對魚類的代謝有不同的影響。例如，在歐洲鱸魚飼料中使用蝦粉代替魚粉，發(fā)現(xiàn)前者顯著促進(jìn)鱸魚的肝臟脂質(zhì)代謝，另有研究發(fā)現(xiàn)魚飼料中的藻類影響了大西洋鮭魚幼魚的脂肪酸代謝。

總之，基于飼料添加劑EQ對羅非魚微生物群落和代謝以及消費(fèi)者健康的潛在影響，本工作使用典型的含或不含EQ的低脂和高脂飼料培養(yǎng)了GIFT，然后研究了魚的生長性能、腸道穩(wěn)態(tài)、微生物群和代謝，并討論了對消費(fèi)者潛在的二次生物危害。這項(xiàng)工作為指導(dǎo)EQ在魚類養(yǎng)殖中的安全應(yīng)用提供了理論依據(jù)和實(shí)際數(shù)據(jù)支持。

Results and Discussion

EQ改變了GIFT的增長表現(xiàn)

為了研究EQ如何影響GIFT的生長，魚被用包括0.03% EQ的典型低脂和高脂飼料培養(yǎng)。如圖所示。圖1A和B，在低脂飲食的條件下，添加EQ到飼料中增加了體質(zhì)量增長，但同時(shí)也分別上調(diào)了FCR 32.4%和8.6%，這與先前的研究結(jié)果一致。作為抗氧化劑，EQ可以防止飼料中的脂質(zhì)酸敗和蛋白質(zhì)氧化，保持脂溶性維生素的穩(wěn)定性，并保護(hù)飼料中的營養(yǎng)成分和促進(jìn)生長性能，特別是在脂肪攝入量受限時(shí)。然而，在高脂飼料的情況下，在有EQ的情況下，體質(zhì)量增加和FCR都降低了（分別為16.5%和1.6%）。一些研究表明，高劑量的抗氧化劑補(bǔ)充劑可能是有害的，因?yàn)檫@可能會(huì)改變體內(nèi)保護(hù)細(xì)胞免受損傷的微妙平衡。此外，在低脂喂養(yǎng)條件下，添加EQ顯著降低了存活率，但在高脂喂養(yǎng)的情況下，添加EQ對存活率沒有顯著影響（圖1C）。這些結(jié)果表明，EQ的應(yīng)用對GIFT的生長性能有不同的影響，這取決于飼料的脂肪含量。

圖1 不同飼養(yǎng)條件下GIFT的生長表現(xiàn)

EQ導(dǎo)致GIFT腸道組織屏障損傷

為了解釋EQ如何改變GIFT的生長性能，建議EQ可能調(diào)節(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而影響營養(yǎng)吸收。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，通過組織學(xué)確定了腸屏障的功能。在前面（圖2A）和中間（圖2B）腸段，當(dāng)?shù)椭嬍硨?dǎo)致腸屏障完好時(shí)，添加EQ會(huì)導(dǎo)致多絨毛損傷。此外，高脂飲食導(dǎo)致低水平的腸屏障損傷，而添加EQ進(jìn)一步加劇了損傷。因此，EQ在高脂和低脂飼料中都顯著損傷了腸屏障。相反，各組的腸屏蔽在后部（圖2C）段完好無損，表明在前一段中，EQ通過消化和吸收而失效。

圖2 不同組別GIFT腸段的HE染色

EQ調(diào)節(jié)GIFT的微生物群

EQ調(diào)節(jié)肌肉和腸道微生物群的組成

為了評估飲食中的EQ是否調(diào)節(jié)了魚類的微生物群，以及改變后的微生物群是否可以被消費(fèi)者接觸，通過16S rDNA測序確定了魚肉和腸道的微生物群。

先前的研究表明，魚類腸道微生物群主要由四個(gè)門組成，分別是：Proteobacteria、Fusobacteria、Actinobacteria和Firmicutes。同樣，本研究還發(fā)現(xiàn)這4個(gè)科在腸道中占優(yōu)勢。值得注意的是，這四個(gè)門也在肉微生物群中占主導(dǎo)地位，這表明肉微生物群的主要來源是腸道。另一方面，在屬水平上，GIFT肉和腸中的優(yōu)勢菌包括蠟狀芽孢桿菌，萊斯頓菌，根瘤菌，鄰單胞菌，腸桿菌和埃希氏-志賀氏菌（圖3B）。蠟狀芽孢桿菌和棒狀桿菌被報(bào)道為魚類腸道中常見的優(yōu)勢菌。當(dāng)蠟狀芽孢桿菌也在肉中大量存在時(shí)，根瘤菌的比例較低，此外，高豐度的腸桿菌只在肉中觀察到，而不是在腸道中。在優(yōu)勢菌屬中，鄰單胞菌由一種單菌種組成，志賀氏鄰單胞菌，一種常見的革蘭氏陰性細(xì)菌，已知對魚類具有致病性，與因食用魚類而引起的胃腸道疾病爆發(fā)有關(guān)。埃希氏-志賀氏菌也被認(rèn)為是魚類的致病菌，并引起人類急性腸道傳染病。普氏菌和埃希氏菌-志賀氏菌在喂食EQ的魚肉中含量較高，表明飼料中的EQ可能會(huì)增加魚感染的風(fēng)險(xiǎn)，并導(dǎo)致潛在的GIFT二次生物危害。

圖3 EQ改變了GIFT的微生物群組成

EQ降低了微生物群的多樣性

為了評估不同群體的微生物群穩(wěn)態(tài)，α-和β-多樣性聚類OTUs進(jìn)行了測量。稀釋曲線（圖4A）表示，測序深度足以進(jìn)行進(jìn)一步分析。在OTU聚類分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行韋恩圖分析，結(jié)果表明肉和腸的核心菌群分別由146個(gè)和180個(gè)OTU組成（圖4B）。此外，α-多樣性由Chao1和Shannon多樣性指數(shù)（圖4C和D）。雖然Chao1指數(shù)在組間差異有限，但香農(nóng)指數(shù)的差異顯著。具體來說，在肉樣本中，低脂和高脂飼料在沒有EQ的情況下沒有顯著差異，但應(yīng)用EQ顯著降低了低脂和高質(zhì)量飼料的GIFT中的香農(nóng)指數(shù)。另一方面，在腸道樣本中，高脂飼料和EQ均降低了香農(nóng)指數(shù)，但在HFHE組中效果沒有疊加。由于Chao1反映了物種豐富度，而Shannon反映了物種多樣性，這一結(jié)果表明，EQ通過減少肉和腸中的物種多樣性而不是物種豐富度來損害α-多樣性。

圖4 EQ降低了α-多樣性GIFT微生物群

同時(shí)，β-多樣性通過PCA（圖5A）和NMDS（圖5B）以評估組間微生物群落相似性。PCA顯示，EQ顯著改變了高脂飼養(yǎng)魚肉和低脂飼養(yǎng)的魚腸中的微生物群組組成，而NMDS顯示，EQ僅在高脂飼喂魚肉中調(diào)節(jié)微生物群。考慮到NMDS包含一種排序方法，以克服線性模型（包括PCA）的缺點(diǎn)，并能更好地反映非線性結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，EQ可以改變高脂飼料中魚肉的微生物群，這可能導(dǎo)致不確定的生物危害風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 EQ降低了β-多樣性GIFT微生物群

EQ改變微生物群的功能

為了進(jìn)一步研究EQ如何調(diào)節(jié)GIFT的微生物群，分析了不同細(xì)菌的功能。COG通路的聚類分析顯示，添加和不添加EQ的GIFT在信息存儲(chǔ)和處理、細(xì)胞過程和信號(hào)傳導(dǎo)以及代謝方面存在顯著差異（圖6A）。有趣的是，在肉類微生物群中，高脂飼養(yǎng)組和低脂飼養(yǎng)對EQ的影響不同。在高脂飼喂組中，EQ上調(diào)了涉及細(xì)胞過程和信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)菌，但下調(diào)了具有代謝功能的細(xì)菌；而在低脂飼喂群中，EQ的效果則相反。KEGG通路簇分析顯示，在群體感應(yīng)通道（K02032、K02035、K02034）和次級代謝產(chǎn)物的生物合成通道（K02495）中，EQ和非EQ組之間存在顯著差異（圖6B）。這些結(jié)果表明，EQ調(diào)節(jié)了GIFT在肉和腸道中的微生物群功能，其具體影響在很大程度上取決于喂養(yǎng)條件。另一方面，肉微生物群代謝的變化可能潛在地影響消費(fèi)者的健康，需要進(jìn)一步研究。

圖6 EQ改變了微生物群的功能

EQ負(fù)面調(diào)節(jié)GIFT肉中的有益代謝產(chǎn)物

EQ顯著改變了肉類代謝組

基于微生物群數(shù)據(jù)，建議EQ喂養(yǎng)會(huì)改變魚肉微生物群的代謝，此外，在飼料中添加EQ也可能改變魚的肌肉代謝。為了了解EQ對GIFT魚肉代謝的全面影響，每個(gè)組的代謝物通過基于LC-MS/MS的非靶向代謝組進(jìn)行評估。PCA顯示，在低脂和高脂組中，添加和不添加EQ的飼料形成了兩個(gè)不同的團(tuán)簇（圖7）。同樣，正交部分最小二乘歧視分析（OPLS-DA）表明，在喂養(yǎng)和不喂養(yǎng)EQ的GIFT的肉中，代謝物發(fā)生了顯著變化（圖8A）。排列測試結(jié)果表明，原始模型具有良好的魯棒性，不存在過擬合現(xiàn)象（圖8B）。這些結(jié)果表明，EQ顯著改變了GIFT的肉類代謝組。

圖7 通過主成分分析（PCA）對GIFT肉進(jìn)行代謝組學(xué)分析

圖8 通過正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）對GIFT肉進(jìn)行代謝物分析

EQ降低了肉中有益的代謝產(chǎn)物

為了進(jìn)一步了解EQ如何改變魚肉的代謝，通過火山圖可視化了每組變化的代謝產(chǎn)物（圖9A）。在低脂和高脂飼養(yǎng)組中，添加EQ顯著改變了肉類代謝物的類型。此外，對代謝組進(jìn)行了層次聚類分析，詳細(xì)分析了各組之間的差異代謝物。計(jì)算了差異代謝物質(zhì)定量值的歐幾里得距離矩陣，并采用完全連鎖方法對差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行聚類。在低脂飼養(yǎng)（圖9B），γ-氨基丁酸（GABA）和琥珀酸酐在添加EQ后顯著上調(diào)。GABA是去甲腎上腺素的代謝產(chǎn)物和一種神經(jīng)遞質(zhì)，具有顯著的有益作用，但也可能引起一些癥狀，如服用GABA后不久，一些人可能會(huì)出現(xiàn)輕微的皮膚刺痛和/或輕微的呼吸短促。另一方面，EQ的應(yīng)用下調(diào)了8種代謝物，如唾液半乳糖、半胱氨酸、核糖、異鼠李素和N-乙酰氨基丁酸，這些代謝物對于人體來說是必需的或有益的。如圖9C所示，在高脂喂養(yǎng)組中，添加EQ顯著上調(diào)了肌苷、癸酸和甲基琥珀酸的濃度。值得注意的是，甲基丁二酸是一系列異常和潛在有害的，因此從肉中攝入甲基丁二酸可能會(huì)對健康造成潛在危害。此外，在EQ處理后，對身體有益的氨基酸和維生素，如色氨酸和泛酸，被下調(diào)，這表明EQ可能對GIFT肉的營養(yǎng)價(jià)值產(chǎn)生負(fù)面影響。

值得注意的是，在低脂飼料組和高脂飼料中，應(yīng)用EQ顯著下調(diào)了微生物糖的含量。但對微生物糖對人體生理作用的了解有限，EQ誘導(dǎo)的變異是否會(huì)影響消費(fèi)者的健康是一個(gè)有趣的問題，需要進(jìn)一步研究。

圖9 EQ減少了肉中的有益代謝物

Conclusion

EQ是一種廣泛使用的魚飼料添加劑，但對其對魚類和消費(fèi)者的潛在有害影響尚未完全了解。在這項(xiàng)工作中，評估了EQ對高脂和低脂飼料中GIFT生長和健康的影響，并調(diào)查了對消費(fèi)者潛在的二次生物危害。在低脂飼料條件下，EQ不僅上調(diào)了體質(zhì)量增加，還上調(diào)了FCR，并降低了存活率。相反，在高脂飼料條件下，情報(bào)下調(diào)了體質(zhì)量增加，并沒有在很大程度上改變FCR和GIFT的存活率。此外，在兩種喂養(yǎng)條件下腸絨毛都受損。給予EQ導(dǎo)致了肉類微生物群的不同組成和較低的多樣性，特別是在低脂喂養(yǎng)組。具體來說，EQ上調(diào)了鄰單胞菌和大腸桿菌-志賀菌的比例在GIFT的體內(nèi)微生物群中，這些是潛在的病原體。此外，EQ還改變了肉類代謝組，減少了有益的代謝產(chǎn)物，增加了潛在的有害成分。綜上所述，本文闡明了EQ對GIFT生長性能的影響，并暗示了對消費(fèi)者潛在的二次生物危害。這些發(fā)現(xiàn)為指導(dǎo)EQ在飼料中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)，并促進(jìn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)和管理的改進(jìn)。

The effect of feed additive ethoxyquin on tilapia growth performance and potential secondary hazard to consumers

Shanjun Chena, Chong Wanga, Yanan Liua, Zhigang Zhoub, Linglin Fua, Yanbo Wanga,c,*

a Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China

b Sino-Norway Joint Lab on Fish Gut Microbiota, Institute of Feed Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

c School of Food and Health, Beijing Technology and Business University (BTBU), Beijing 100048, China

*Corresponding author.

Abstract

Ethoxyquin (EQ) is a widely used feed additives for aquaculture, but the potential hazard to fish and consumers are not fully understood. In this work, EQ was applied to tilapia fed with either high-fat or low-fat feed, and the changes in growth performance and intestinal barrier integrality of genetically improved farmed tilapia was observed. Additionally, the microbiota in the intestinal content and flesh was analyzed by 16S rDNA sequencing, and the flesh metabolites was measured by LC-MS/MS untargeted metabolomics. In the low-fat group, EQ increased weight gain and feed conversion rate, but reduced survival rate. In the high-fat group, only weight gain decreased, and there was no significant effect on feed conversion rate and survival rate. Additionally, the intestinal villi and microbiota diversity was impaired in both feeding conditions. Microbiota analysis revealed that EQ resulted in different composition and lower diversity of the flesh microbiota and upregulated the proportion of potential pathogens. EQ also changed the flesh metabolome, decreasing beneficial metabolites and increasing potential harmful components. This work elucidated the effect of EQ on growth performance of tilapia and implied that it has adverse effects on tilapia and may be passed on to consumers.

Reference:

CHEN S J, WANG C, LIU Y N, et al. The effect of feed additive ethoxyquin on tilapia growth performance and potential secondary hazard to consumers[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3236-3244. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250010.

翻譯：田雨欣（實(shí)習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創(chuàng)意

為深入探討未來食品在大食物觀框架下的創(chuàng)新發(fā)展機(jī)遇與挑戰(zhàn)，促進(jìn)產(chǎn)學(xué)研用各界的交流合作，由北京食品科學(xué)研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監(jiān)督管理總局技術(shù)創(chuàng)新中心（動(dòng)物替代蛋白）及中國食品雜志社《食品科學(xué)》雜志、《Food Science and Human Wellness》雜志、《Journal of Future Foods》雜志主辦，西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院、四川旅游學(xué)院烹飪與食品科學(xué)工程學(xué)院、四川輕化工大學(xué)食品與釀酒工程學(xué)院、成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院、成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所、四川大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工研究院、西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院、宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院、大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北京聯(lián)合大學(xué)保健食品功能檢測中心共同主辦的“第二屆大食物觀·未來食品科技創(chuàng)新國際研討會(huì)”即將于2025年5月24-25日在中國 四川 成都召開。

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