摘要：由于當前生物治療市場由抗體分子主導，雙特異性抗體是下一代抗體療法的關鍵組成部分。雙特異性抗體可以同時靶向兩種不同的抗原，例如同時結合腫瘤細胞受體和募集細胞毒性免疫細胞。雙特異性抗體領域的結構多樣性一直在快速增長，產生了大量新型雙特異性抗體支架，它們提供了極大的功能多樣性。市場上兩種常見的雙特異性抗體形式是基于單鏈可變片段（ scFv ） （無 Fc 片段）的抗體和全長 IgG 樣不對稱抗體。與傳統的單克隆抗體不同，雙特異性抗體在數量、質量和穩定性方面面臨的巨大生產挑戰阻礙了其更廣泛的臨床應用和接受。這篇綜述重點介紹了這兩種主要的雙特異性類型，并描述了這些分子的設計、生產和質量方面的最新進展，這將使這一重要的生物制劑能夠發揮其治療潛力。

圖1：(a）人IgG1結構圖示，其中N-糖附著在Fc區CH2的Asn297位點。（b）癌癥治療中抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、補體依賴性細胞毒性（CDC）和抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（ADCP）機制示意圖。

【NO.1】單鏈可變片段（scFv）抗體

單鏈可變片段（scFvs）是功能性抗體的極簡形式，通過柔性多肽接頭將IgG重鏈（VH）和輕鏈（VL）的可變結構域融合產生。ScFv分子的分子量在25kDa范圍內，具有一個抗原結合位點，由抗體每個臂的組分組成。開發scFv抗體的幾個重要考慮因素是抗體片段類型、接頭類型和生產能力。最近，使用scFv技術的另一個令人興奮的領域是用于過繼細胞轉移免疫治療的嵌合抗原受體（CAR）T細胞方法。鑒于本綜述的范圍和數量，本文將不討論scFvs治療CAR-T的應用。

1.1.抗體片段類型

目前，有三種主要的雙特異性抗體片段形式：雙特異性T細胞接合器（BiTE）、雙親和力再靶向蛋白（DART）和串聯雙抗體（TandAbs），如圖2a所示。

最成功的BiTE藥物之一是blinatumomab（Blincyto，DrugBank? entry DB09052），它已被FDA批準用于治療B細胞前體急性淋巴細胞白血病 （ALL）。Blinatumomab由一個VL-VH方向的抗CD 19 scFv組成，該抗病毒通過短甘氨酸/絲氨酸（GGGGS）接頭連接到VH-VL方向的抗CD3 scFv 。blinatumomab的機制如圖 2b所示。

圖2.（a）構建三個主要的雙特異性抗體片段分子。（b）Blinatumomab治療的機制。

1.2.Linker工程

輕鏈和重鏈結構域之間的接頭區域在穩定抗體方面起著重要作用，因此是優化scFvs的重要靶標。scFv可以與VH-linker-VL或VL-linker-VH形式的單個多肽鏈組裝，其中接頭橋接了相應結構域的C和N末端之間的間隙。對重鏈和輕鏈結構域取向的研究表明，兩種取向在不同情況下都是有利的，并且接頭設計可能會影響生物物理性質[53,54,55]。接頭設計中的兩個基本考慮因素是氨基酸組成和序列長度。首先，氨基酸組成對于設計可行且靈活的接頭肽至關重要;例如，在蛋白質折疊過程中，親水序列對于避免肽在V結構域內或之間嵌入是必不可少的。目前，最常用的氨基酸序列基序是（G4S）n（G：甘氨酸，S：絲氨酸;G4S是4個甘氨酸殘基和1個絲氨酸殘基）。甘氨酸和絲氨酸是首選，因為它們的短側鏈具有構象靈活性和最小的免疫原性，而絲氨酸還提高了溶解度。除了傳統的Gly-Ser接頭外，其他設計還包括帶電殘基，如谷氨酸和賴氨酸，以提高溶解度，而噬菌體展示等高通量選擇方法也有助于設計和生成專門針對某些抗體優化的接頭。

除了組成之外，Fv結構域的重鏈和輕鏈之間的接頭長度對于組裝scFv的正確構象也至關重要。據報道，接頭應該能夠在一個V結構域的C端和另一個V結構域的N端之間跨越3.5nm（35?），而不會影響天然Fv構象。接頭的長度對抗體的多聚體形成有顯著影響，研究表明，接頭長度超過12個氨基酸殘基可以使重鏈和輕鏈結構域之間有足夠的距離來結合并形成單體。連接VH和VL的較短接頭可以防止兩個結構域的直接結合，從而增加不同scFv分子的重鏈和輕鏈配對的可能性，形成二聚體、三聚體或更高階的寡聚體。因此，通過正確設計接頭長度，可以有效地促進設計為雙抗體（特別是TandAbs分子）的scFv分子的形成，或者其多價形式優于其單價形式。例如，藥代動力學研究表明，對于特定抗體（如CC49），二聚體或四聚體的形成是有利的，與單體形式相比，它改善了腫瘤靶向性，同時保持了有效的體內腫瘤定位和血液。因此，設計接頭長度以實現所需的scFv構象或多價形式的分布至關重要。

為最佳雙特異性scFv構型設計接頭需要仔細考慮上述原則。構建雙特異性scFv的初步嘗試集中在設計直接連接兩個單價單鏈抗體的連接子上。這些設計的例子包括由24個氨基酸組成的接頭CBH1和具有25個氨基酸殘基的205C接頭。這些鏈間接頭的氨基酸組成等因素會影響單鏈雙特異性抗體的功能。最近的接頭設計更強調接頭長度和實現所需的抗體構象和結構域關聯，這可以通過BiTE、DART和TandAb來說明，如圖2a所示。為了成功構建雙特異性scFv，控制接頭長度以避免或盡量減少異源抗體重鏈和輕鏈之間的非同源配對非常重要，因為適當的VH-VL結合對于確保正常功能的抗體親和力和特異性至關重要。BiTE設計在同源結構域的重鏈和輕鏈之間放置長接頭以確保結合，在異源重鏈片段之間放置短接頭（GGGGS接頭）以形成兩個Fv之間的連接。DART分子是雙鏈，它們相互結合形成功能性二聚體，其中VHA和VLB或VHB和VLA之間的接頭需要短至5個氨基酸，以防止不需要的非同源配對。此外，二硫鍵的定位是DART分子的另一個關鍵特征，它將分子以正確的方向固定在一起。TandAb的接頭設計類似于DART，相鄰結構域之間的接頭是六個氨基酸（GGSGG），因此兩條相同的鏈可能結合并形成有利于體內半衰期的大二聚體。

1.3.scFv抗體的穩定性工程

scFv分子的穩定性是一個關鍵因素，因為人們認為穩定性和生物活性之間存在直接相關性[72\u201273]，穩定的scFv分子可以被視為功能性雙特異性抗體的組成部分。在下文“雙特異性scFv表達和生產”中討論了通過改變表達環境和引入輔助分子（例如伴侶）來提高scFv溶解度和穩定性的多種不同方法。在本節中，我們重點介紹通過直接修飾scFv框架實現優化蛋白質穩定性的方法。設計scFv結構的兩種常用方法包括環接枝和誘變。環接枝方法可能有利于治療性scFv的產生，因為該過程通過將抗原特異性互補決定區（CDR）移植到具有適當生物物理特性（包括穩定性）的框架上，一步實現了穩定和人源化。例如，Borras等報道了通過將15種不同兔單克隆抗體的CDR嫁接到人scFv支架上，成功嘗試了兔可變結構域的人源化和穩定化，從而產生了相似的親和力，但生物物理特性顯著改善?；蛘撸瑢τ谡T變方法，通過合理的位點特異性突變或定向蛋白質進化（即誘導隨機誘變，然后是陽性選擇步驟）來實現增強的穩定性]。

與需要迭代步驟才能達到最佳效果的費力的定向進化方法相比，使用成熟的技術相對容易實現位點特異性誘變方法。位點特異性突變的合理設計通常是基于知識的，不同的突變可以組合和同時引入，前提是突變對提高穩定性具有累積效應。例如，最常見的基于突變的優化方法之一是共有序列方法，其中假設同源Fv結構域中任何位置最頻繁的氨基酸在考慮分子進化和選擇時有助于穩定性，并且預計朝向該集體共有序列的突變將對穩定性產生積極影響。除了共有方法外，其他方法還會改變氨基酸殘基以實現某些目標，例如創建結構域間二硫鍵、創建分子內氫鍵和優化疏水性。作為利用這些基于突變的方法的成功案例，Miller等結合使用了基于序列的統計分析（殘基頻率分析和一致性方法）和基于結構的設計方法來鑒定VH和VL序列中突變的目標殘基。然后，通過熱激發的高通量抗原結合測定篩選scFv突變體。分離的穩定性工程scFv變體能夠在懸浮的中國倉鼠卵巢細胞中產生高產量（21.5mg/L）、純度和生物活性高。

1.4.雙特異性scFv抗體的表達和生產

合適的宿主平臺是scFv抗體高效表達和生產的決定因素，存在幾種不同的scFv表達活平臺，包括細菌、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物和無細胞系統。鑒于雙特異性scFv由兩個或多個scFv分子組成，雙特異性scFv的各種表達宿主可能與用于生產scFv單分子的表達宿主不同。雙特異性scFv蛋白的“最佳”表達系統尚未確定，因為重組蛋白的大小、氨基酸序列和構象的差異使得很難得出一個通用的表達系統來優化蛋白質的產量和質量，這可能受到許多因素的影響，如溶解度和穩定性。然而，表1中列出的幾項研究報道了使用細菌和哺乳動物系統成功表達雙特異性scFv及其融合分子。

表1.雙特異性抗體片段分子在各種宿主中的表達示例

【NO.2】全尺寸IgG樣不對稱雙特異性抗體

盡管IgG樣不對稱雙特異性抗體具有一些與天然單克隆抗體相似的特性，但它們是工程分子，不是由典型B細胞產生的。因此，這些差異導致了重大的生產挑戰。不對稱IgG樣雙特異性抗體生產面臨的最大挑戰之一是確保抗體片段的正確組裝，這是雙特異性抗體大規模生產的先決條件。4條獨特的多肽鏈（2條不同的重鏈和2條不同的輕鏈）的隨機組裝產生了16種組合（10種不同的分子構型），其中只有2種代表理想的不對稱異二聚體雙特異性抗體（占統計概率的12.5%）。其余配對導致無功能或單特異性分子。因此，通過優化雙特異性抗體的正確組裝，不僅可以提高大腸桿菌和哺乳動物細胞產生的雙特異性抗體的質量，還可以大大提高其數量。表2總結了幾種IgG樣雙特異性抗體分子的生產實例。要產生所需的IgG樣雙特異性抗體，主要必須解決兩個問題——兩種不同重鏈的異二聚化和兩種輕鏈/重鏈相互作用之間的區分。已實施明智的遺傳和細胞工程策略，例如quadroma技術、旋鈕入孔、常見的重鏈和常見的輕鏈策略、CrossMab和共培養方法，以產生優化的Y形IgG樣雙特異性抗體。我們將在以下各節中簡要介紹這些重要策略中的每一種。

表2.IgG樣雙特異性抗體分子在各種宿主中的表達示例

2.1.Quadroma（或雜交雜交瘤）技術

最初，通過兩個雜交瘤的體細胞融合產生雙特異性抗體，如圖3a.所示。每個雜交瘤細胞都表達一種具有預定義特異性的獨特單克隆抗體。然后，兩個表達抗體的細胞融合，產生的雜交雜交瘤細胞表達來自親本雙方的免疫球蛋白重鏈和輕鏈，其中組裝允許形成親本和雜交免疫球蛋白。quadroma技術代表了雙特異性抗體生產的基礎，但也存在產量低和產品異質性高的問題。理論上，兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈的隨機組裝可以產生10種不同的分子構型，其中只有一種是功能性雙特異性抗體。quadroma細胞系中功能性雙特異性抗體的實際百分比是不可預測的，并且需要一個費力的過程才能從副產物中分離雙特異性抗體。后來，通過將小鼠和大鼠雜交瘤細胞系融合開發了一種嵌合四元瘤技術。與傳統小鼠/小鼠或大鼠/大鼠四肢體中的隨機配對相比，由于優先物種限制性重/輕鏈配對，嵌合小鼠/大鼠bsAb的含量顯著富集。此外，大鼠重鏈不與蛋白A結合進行純化，而bsAbs中的小鼠重鏈可以在pH5.8下洗脫，而全尺寸親本小鼠抗體可以在pH3.5下洗脫。此功能通過蛋白A和離子交換層析提供了一種簡單易行的純化過程，以分離所需的雙特異性組分。

隨著quadroma技術的改進，卡妥索單抗（抗EpCAMx抗CD3）于2009年成為歐洲首個獲批用于惡性腹水患者腹腔治療的IgG樣雙特異性抗體?？ㄍ姿鲉慰故峭ㄟ^quadroma技術產生的，由小鼠IgG2a和大鼠IgG2b組成。作為一種三功能抗體，一個Fab抗原結合位點通過CD3受體結合T細胞，另一個位點通過腫瘤抗原上皮細胞粘附分子（EpCAM）結合腫瘤細胞，Fc區提供第三個結合位點，通過與FcγRI、IIa和III受體結合來募集和激活免疫效應細胞。然而，卡妥索單抗不能與抑制性FcγIIb受體結合。免疫原性是另一個問題——卡妥索單抗治療患者有時會觀察到人抗小鼠或抗大鼠抗體反應。

2.2.重鏈組件

Fc異二聚化是一種特別重要的設計，它可以減少不同形式的可能組合的數量，同時通過消除正常單克隆抗體的形成來專門產生不對稱抗體。異二聚體重鏈是通過組合兩條互補但不相同的重鏈實現的，這些重鏈形成單個重鏈組合。然后，每條重鏈可以與不同的輕鏈結合，從而產生四種可能性：一個雙特異性分子、一個非功能性組合和兩個單特異性分子。因此，使用這種方法，可能的抗體組合從10種不同的分子大幅減少到僅剩4個分子。Fc的二聚化是通過Fc的CH3結構域（恒定區的最后一個結構域）相互界面實現的?？梢詰貌煌募夹g來設計CH3結構域，以便兩個不同的Fc結構域可以正確地相互連接，如圖3b所示。

圖3：提高IgG樣雙特異性抗體產品質量的策略。（a）quadroma技術的說明。（b）實現均相不對稱異二聚體雙特異性抗體產品的重鏈和輕鏈遺傳和蛋白質工程策略的總結。

Knobs-into-holes技術涉及工程化CH3結構域，在每個重鏈上創建一個“旋鈕”或“孔”，以促進Fc異二聚化，已廣泛應用于Fc工程。FrancisCrick首先提出了knobs-into-holes模型，用于填充蛋白質卷曲螺旋α-螺旋結構域的氨基酸骨架。Ridgway等人將旋鈕插入孔作為一種新的設計策略，以設計Fc結構域的重鏈，使其能夠形成異二聚體。用較大的氨基酸（T366Y）替換CH3結構域中的小氨基酸以形成旋鈕變體，用較小的氨基酸（Y407T）替換另一個CH3結構域中的大氨基酸以產生一個孔，以便兩個工程結構域可以相互適應，從而有利于異二聚化。此外，發現CH3結構域中包括S354C和T366W在內的其他突變位點會產生旋鈕，而Y349C、T366S、L368A和Y407V在另一個CH3結構域中檢查孔，而L351C用于形成二硫鍵并進一步增強異二聚化。根據三個標準確定和檢查工程位點：（1）α-碳之間的距離應在5.0-6.8?左右，這是在自然形成的二硫鍵中發現的平均距離，但最高可達7.6?;

（2）氨基酸殘基的配對應與每個天然CH3界面上的配對不同;

（3）半胱氨酸殘基之間二硫鍵的形成在構象上應該是有利的。

因此，在共表達條件下，重鏈（HC）異二聚化進一步提高高達95%，使其能夠進行放大生產。旋鈕入孔異二聚體化不僅通過雙特異性抗體的正確異二聚體配對解決了重鏈問題，而且還使它們構象穩定，并允許通過蛋白A純化抗體。Zhang等人證明了與孔-孔同型二聚體變體相比，旋鈕入孔異二聚體的穩定性，進一步支持了旋鈕入孔異二聚體化是一種合理的設計策略。異聚重鏈產生功能性雙特異性抗體，并且還保留了Fc介導的效應子功能，例如ADCC。與產生非糖基化抗體的大腸桿菌宿主系統相比，哺乳動物宿主表達系統可以產生糖基化、效應功能感受態異二聚體抗體。一項研究表明，通過旋鈕入孔技術將CHO細胞的一半不對稱抗CD20抗體進行AFUCOSYLATION足以產生類似于完全AFUCOSYLATION對稱野生型抗CD20抗體觀察到的ADCC增強。

或者，鏈交換工程結構域（SEED）異二聚化代表了另一種基于空間突變的設計策略，它利用源自IgG和IgACH3結構域（也稱為AGSEEDCH3和GASEEDCH3）的交替序列的互補性。IgG和IgACH3衍生物產生互補序列，因此組裝兩個互補的重鏈異二聚體，同時排除缺乏互補性的同源二聚體組裝。根據Muda等人的研究，Fab-SEED融合保留了與其他抗體相當的理想結合親和力和特性，包括良好的藥代動力學和穩定性。

除了前面提到的空間位位突變外，靜電轉向相互作用也被廣泛用于促進重鏈異二聚體的形成，方法是分別用帶負電荷的天冬氨酸或谷氨酸殘基或谷氨酸殘基和帶正電荷的賴氨酸殘基取代CH3結構域中的一個殘基和另一個CH3結構域中的另一個殘基。然后，電荷對取代有利于異二聚體的組裝，同時通過靜電排斥抑制同源二聚體的形成。Gunasekaran等人首先證明了抗體的Fc異二聚化，利用靜電導向效應應用于雙特異性抗體的生產。在他們的工作中，應用了新的工程策略來支持異二聚體之間有利的相反電荷相互作用，并通過分別用天冬氨酸和賴氨酸取代不同CH3結構域中的K409和D399來誘導同型二聚體之間不利的排斥電荷相互作用，以抑制同型二聚體的形成。

事實上，位點特異性突變可以通過規避重鏈問題來顯著提高雙特異性抗體的質量和數量。然而，空間位位突變和電荷對的引入會降低雙特異性抗體的熱穩定性。Moore等報道了一種稱為XmAb雙特異性平臺的有效方法，該方法結合了電荷相互作用、CH3結構域的構象方面和氫鍵，從而增強了熱穩定性。新的Fc突變包括天然IgG1與S364K和K370S異二聚體的側鏈交換，以形成氫鍵，然后是L368D/K370S取代以驅動鹽橋相互作用。根據最小暴露面積指定和選擇工程化的Fc位點，以確保在不干擾受體結合或產生額外潛在N-連接糖基化位點的情況下實現近乎凈等體積的替換。此外，由于工程結構和電荷對突變，驅動位點之間的空間位阻和電荷排斥不利于同型二聚體的形成。此外，還檢查和設計了這些位點以調節兩個CH3位點之間的不同等電點（pI）。這對于大規模提高異二聚體Fc平臺的穩定性特別有意義，因為異二聚體的工程化pI與同型二聚體的pI明顯不同，可以促進和簡化通過標準離子交換色譜從非雙特異性抗體中純化異二聚體雙特異性抗體的過程，其性能與雙特異性抗體的可變結構域和形式無關。

總之，雙特異性抗體重鏈異二聚化，尤其是在CH3區域內，代表了一種迅速出現的方法，包括多種設計策略，例如空間突變、靜電轉向相互作用和重鏈電荷差異，以促進純化。這些方法通常一起應用，以實現雙特異性抗體重鏈異二聚化，同時形成最少的同型二聚體。然而，另一種策略是生成一個具有1個lambda和1個kappa輕鏈的公共重鏈，無需任何修改，稱為κλ（κλ）體。在CHO或HEK293細胞中，重鏈和一個κ和一個λ的共表達產生了單特異性和雙特異性抗體。據報道，輕鏈的表達是雙特異性抗體特異性和親和力的決定因素。然后采用特異性用于κλ和λ單特異性抗體分離的色譜柱，然后進行蛋白A純化，盡管最終產物中只有約50%是κλ體，其余主要包括κλ-κ和λ-λ抗體副產物。有趣的是，另一個研究小組報道，κλ鏈序列的密碼子去優化使κλ體產量增加了兩倍，并增強了雙特異性抗體在低κλ鏈表達κλ體細胞系中的相對分布。

2.3.重鏈和輕鏈組件

雖然FcCH3結構域的刻意修飾能夠實現正確的重鏈異二聚化，但使用兩種不同的輕鏈仍然會導致所需雙特異性抗體的產量較低（產生四種不同的組合，其中只有一種是雙特異性的）。因此，已經開發了先進的方法，允許輕鏈和重鏈的正確配對，以解決不正確的重鏈和輕鏈相互作用問題，例如常見的輕鏈方法和CrossMab來部分交換VH和VLFab片段。這些策略通常與Fc修飾的重鏈結合使用，如圖3b所示。

首先，采用一種常見的輕鏈策略來組裝IgG樣雙特異性抗體，這些抗體可以與旋鈕入孔方法組合在一起。常見輕鏈策略的機制基于這樣一個事實，即從針對不同抗原的階段展示篩選中發現的抗體通常共享相同的VL結構域，這反映了噬菌體文庫中L鏈庫的大小非常有限。常見的輕鏈形式的巨大優勢之一是它允許使用簡化工業生產中抗體工程和純化過程的方法。例如，根據計算預測，一個被稱為“DEKK”的Fc變體對由一條重鏈中的L351D和L368E取代組成，另一條重鏈中的L351K和T366K結合推動了抗體重鏈的高效異二聚化。此外，使用共同的輕鏈，在良好生產規范（GMP）條件下，使用標準CHO細胞培養平臺和常規純化方案生產和純化靶向人EGF受體2和3的雙特異性抗體MCLA-128。最近，2017年批準了一種全長雙特異性IgG樣bsAb是emicizumab（Hemlibra?），用于治療血友病A患者。emicizumab基于人源化IgG4的結構進行工程改造，模擬活化的FVIII的功能，以恢復FVIII與凝血因子IX（FIX）和凝血因子X（FX）的結合，而這在血友病A患者中是缺失的。emicizumab的大規模生產是通過三種抗體工程策略的組合實現的——一條普通輕鏈組裝重鏈和輕鏈，改變兩條不同重鏈的電荷以促進抗體純化，以及應用兩種不同重鏈的靜電導向來促進細胞中重鏈的表達.目前，已經開發了許多常見的輕鏈和常見的重鏈發現平臺，以實現bsAb組裝抗體的有效生成。這些方法包括但不限于具有固定單輕鏈的轉基因小鼠，以及具有共同重鏈的篩選噬菌體展示文庫（如上所述）。因此，為了克服雙特異性抗體的穩定性、產量和免疫原性問題，共輕鏈的應用在該領域越來越受歡迎。然而，這種方法可能會降低抗體工程的靈活性，從而在某些情況下限制抗體優化。此外，常見輕鏈的篩選過程需要動物免疫和/或噬菌體展示，由于時間和開發成本，這可能會有問題。

與常見的輕鏈方法不同，CrossMab是通過交換Fab片段的重鏈和輕鏈結構域序列來解決輕鏈問題的最廣泛使用的通用方法之一。Crossmab技術可以生成各種雙特異性抗體，包括雙價、三價和四價抗體，以及其他基于Fab的新型抗體衍生物。通常建議的三種不同格式如圖3b所示。第一種形式涉及簡單地將重鏈的整個Fab臂替換為雙特異性抗體一半的同源輕鏈（CrossMabFab），并且“交叉”仍然保留結合親和力，同時有利于工程化Fab片段的組裝。第二種形式涉及將Fab結構域的VH與其相應的VL結構域（CrossMabVH-VL）交換，以便雙特異性抗體兩個臂中重鏈和輕鏈界面的分子結構不相同，以防止輕鏈錯配。同樣，對于第三種形式，雙特異性抗體的一個臂的CH1和CL也可以互換，以便在重鏈和輕鏈（CrossMabCH1-CL）之間正確組裝。CrossMabCH1-CL不產生理論副產物，而CrossMabFab由于第一個IgG的“VL-CL”和第二個IgG的“VH-CH1”之間的相互作用，會導致形成無功能的單價抗體。CrossMabVH-VL可導致開發類似Bence-Jones的副產品;更具體地說，成功的CrossMabVH-VL應導致“VH-CL”和“VL-CH1”配對，而Bence-Jones樣副產物的“VL-CL”鏈與交叉的“VL-CH1”鏈配對，這意味著兩個輕鏈結構域彼此組裝。理論上，可以通過使兩個常數CH1和CL彼此靜電排斥來防止Bence-Jones樣抗體。

交叉設計已被證明在靶標結合親和力和效力（如抗腫瘤活性）方面有效。Vanucizumab是最早使用CrossMabCH1-CL方法的產品之一，旨在靶向血管內皮生長因子（VEGF）-A和血管生成素-2（Ang-2）。通過使用靶向VEGF-A的原始非突變貝伐珠單抗，同時將CrossMabCH1-CL突變應用于靶向Ang-2的LC06攜帶抗原結合位點，為臨床試驗優化了該設計。此外，引入了二硫鍵穩定的knobs-into-holes突變，以確保正確的重鏈組裝。因此，vanucizumab對患者來源的人腫瘤以及幾種小鼠腫瘤表現出高效性，并且能夠通過Ang-2抑制抑制微轉移生長，而抗VEGF活性對生理血管沒有任何副作用。該技術還被用于生成用于許多不同目的的雙特異性異二聚體抗體。例如，Zhao等人報道的knobs-in-hole和CrossMabCH1-CL技術用于產生靶向CD20和HLA-DR的雙特異性抗體，Huang等人還用于產生最廣泛和最有效的HIV-1中和抗體之一。優化的CrossMab方法非常有效，因此是改善選擇性輕鏈配對的強大設計策略，尤其是與其他設計方法（如旋鈕入孔）結合使用時。交叉設計已被證明可有效實現輕鏈的正確配對，以實現正確的靶標結合親和力，從而獲得高產量。

2.4.共培養法

或者，為了解決輕鏈錯配問題并保留天然抗體結構，Spiess等人提議通過組合兩種不同的半抗體來產生雙特異性抗體，這些抗體在體外表達自兩種不同的細胞系，如圖4所示。然后純化半抗體，并在體外以1：1的摩爾比混合，以生成功能性雙特異性抗體。雖然這種半抗體方法可能有效，但該方法存在一些固有的挑戰。使用兩個獨立的細胞系意味著在體外混合之前必須進行兩個培養容器、收獲和純化過程，這可能會增加成本和污染風險。共培養方法首先在大腸桿菌中得到證明，其中細胞用含有不同半抗體基因（A和B）的質粒轉化，這些基因含有孔狀突起，以防止重鏈在與輕鏈結合之前發生自二聚化。培養后，裂解細胞以收獲半抗體。由于上述過程對于兩種細胞系是相同的，因此可以應用共培養策略來降低風險和成本。將含有半抗體A質粒和半抗體B質粒的大腸桿菌細胞系接種到具有相同細胞編號的同一容器中。對兩種細胞系使用可比較的細胞數量是確保在最后產生相同數量的抗體A和B的一種方法。經過培養和加工，功能性雙特異性抗體被成功檢測和收獲。這種方法已被證明對于設計和生產多種穩定抗體很簡單。

圖4：在大腸桿菌和CHO系統中生產IgG樣雙特異性抗體的共培養方法圖示。（a）大腸桿菌生產容器是通過轉移含有重鏈和輕鏈基因的單個質粒的細胞來構建的，以獲得半抗體。細胞裂解用于收獲半抗體，然后在體外組裝。可以使用單獨培養和共培養系統。（b）與大腸桿菌系統類似，CHO細胞是共轉染的含有重鏈或輕鏈基因的半抗體的單獨質粒。分泌的抗體通過GSH誘導組裝。GSH：還原型谷胱甘肽。

最近，共培養方法已被證明也適用于CHO細胞。雖然方法相似，但所使用的方法之間存在一些差異，主要在質粒的設計、接種和收獲方面。對于CHO細胞，重鏈和輕鏈通過單獨的DNA質粒引入細胞中，以避免非同源的重鏈和輕鏈配對，并確保足夠的抗體滴度。根據抗體滴度和細胞生長速率調整每種半抗體產生的兩種CHO細胞系的比例也很重要，以最大限度地提高1：1摩爾比的半抗體A和B的產生。在收獲之前，添加還原型谷胱甘肽（GSH）以提高雙特異性抗體的生產率，因為CHO細胞仍然可以產生所需半抗體的最小數量的旋鈕或空穴同源二聚體。添加GSH作為還原劑有助于防止半抗體的同源二聚化和二硫化物的形成。在這項研究中，他們還確定了使用共培養生產雙特異性抗體的0.04至40L可擴展范圍。該方法具有抗體設計簡單、風險相對較低、成本較低、與受控Fab臂交換（cFAE）和SEED等當前技術的兼容性，提供了一種簡單有效的工具，可通過共培養分泌半抗體的CHO細胞來生產多種雙特異性抗體。

2.5.IgG樣雙特異性抗體的表達和產生

哺乳動物細胞是工業中IgG生產的主要主力軍，其生產平臺可針對高滴度抗體進行廣泛擴展，以滿足臨床和商業需求。然而，雙特異性抗體的生產更為復雜，通常需要至少兩個異二聚體化重鏈質粒和一個普通輕鏈質粒，如果使用兩種不同的輕鏈，則需要兩個輕鏈質粒。值得注意的是，建議在單獨的質粒上表達HC和LC，因為縱質粒比例是優化所需產物的蛋白質組裝的一種簡單有效的方法。隨后，通常需要一個費力且耗時的過程，從異質穩定轉染子庫中選擇最理想的克隆細胞系進行大規?？贵w生產。CHO細胞以其高蛋白質生產率、低污染率和人類免疫相容性而聞名。通過穩定的CHO細胞產生的抗體表達水平可以達到>3g/L，有時可達>5g/L甚至更高，并在生物反應器中成功放大到大體積。然而，來自CHO細胞的雙特異性IgG樣抗體的產量較低，約為1-3g/L，甚至更低。

與穩定轉染相比，瞬時轉染可在幾天內獲得結果，而無需將重組DNA整合到宿主基因組中。人胚胎腎（HEK293）和基于HEK的Expi293細胞是瞬時表達的人類細胞，已在bsAb發育的早期使用。然而，由于生產雙特異性抗體需要多個質粒，IgG的瞬時表達有時難以擴大規模，并且與穩定細胞系相比，滴度相對較低。作為替代方案，Rajendra等人設計了一種包含所有工程輕鏈和重鏈的單個質粒載體，用于CHO細胞的瞬時和穩定表達。用兩種質粒載體瞬時轉染的CHO細胞庫（其中雙特異性抗體的一個重鏈和輕鏈配對）在單個質粒上，產生0.09-0.15g/L，其中73-92%正確配對的雙特異性抗體通過質譜法確定。用包含雙特異性抗體所有組分的單個質粒載體瞬時轉染的細胞系產生了相似產量的正確配對的雙特異性抗體。然而，具有單個質粒表達的穩定CHO庫導致更高的滴度范圍為0.6至2.2g/L，而正確配對的百分比范圍為74%至98%。他們的結果表明，單個質粒系統在滴度方面可以與多個質粒系統相當，并且可能促進穩定CHO細胞的產生。

事實上，對于體內組裝，工程化重鏈和輕鏈的高效共表達在很大程度上依賴于穩定表達細胞克隆的選擇。此外，溫度等培養條件也會影響半抗體表達和聚集體形成。相比之下，在下游蛋白A純化CH3突變體后，體外組裝（兩種不同重鏈類型的單獨表達，然后在適當的氧化還原條件下混合以誘導組裝）已證明它們能夠產生高質量分子。Duobody技術就是這種情況。隨著IgG4體內和體外的Fab-arm交換（FAE）過程發生，研究人員在IgG1中設計了FAE相關的IgG4特異性突變對，并通過體外組裝產生了穩定的IgG1雙特異性抗體，具有高產量和穩定性。此外，使用基于大腸桿菌的提取物的無細胞表達系統也可以實現合適的雙特異性抗體生產。該系統的靈活性使旋鈕：孔質粒比率的縱成為可能，以實現最有效的HC異二聚體組裝，從而可以在數小時內實現g/L規模的蛋白質產量。盡管如此，這些方法可能包括額外的障礙，例如生產成本增加。因此，在穩定細胞中共表達仍然是IgG樣雙特異性抗體生產的主要方法。

【NO.3】結論和思考

本綜述側重于雙特異性抗體的設計、生產和質量。一個關鍵的挑戰是如何生產具有高質量且副產物和雜質有限或可忽略不計的均一雙特異性抗體。對于scFv型雙特異性抗體，蛋白質穩定性和組織滲透能力各不相同，并取決于不同類型的scFv抗體。此外，由于有多種宿主可供選擇，最合適的系統的確定取決于特定的scFv抗體大小、氨基酸序列、蛋白質構象、溶解度、穩定性、純化和可擴展性。對于IgG樣全尺寸雙特異性抗體，純異二聚體的產生是通過完全重鏈和輕鏈異二聚化實現的。Knobs-intoholes方法是關聯不同重鏈條的有效方法。常見的輕鏈和CrossMab技術也是用于不同輕鏈和重鏈組裝的有用方法。最近，共培養和無細胞系統也成為易于生成雙特異性抗體的互補生產平臺。

抗體領域先進的蛋白質和生產工程技術推動了雙特異性抗體及其衍生物的發展，這是增長最快的下一代抗體療法之一。在雙特異性抗體結構設計中，無論是scFv還是IgG樣形式，還是通過兩者的組合，都獲得了多樣性。此外，添加適配體、親和體和合成藥物等小分子可以進一步擴大其適用性，從而產生大量新型雙特異性抗體相關產品。雙特異性抗體已發現廣泛適用于免疫療法的癌癥治療，這些不同的分子有可能治療其他疾病，如感染、獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）和遺傳病，以及用于醫學診斷目的。展望未來，隨著雙特異性抗體在工業規模上不斷改進其設計、生產和純化，雙特異性抗體將在市場上占據越來越大的份額，并有能力在未來十年內作為傳統療法的補充方法充分發揮其潛力。

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