摘要:重組單克隆抗體在多種疾病治療中應用廣泛，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是生產(chǎn)這類抗體的主要選擇。為提高 CHO 細胞中重組單克隆抗體產(chǎn)量，科研人員從載體優(yōu)化、培養(yǎng)基配方調(diào)整、培養(yǎng)參數(shù)控制和細胞工程等多方面開展研究。本文總結(jié)了這些提升產(chǎn)量的方法，同時分析了生產(chǎn)過程中如抗體聚集、翻譯后修飾異常等挑戰(zhàn)，并探討了相關影響因素，展望了 CHO 細胞在重組單克隆抗體生產(chǎn)領域的發(fā)展前景。

一、研究背景：重組單克隆抗體與 CHO 細胞

抗體是由漿細胞分泌的糖蛋白，在人體中分為 IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD 五類，其中IgG最為常見 ，在血清中占比達 75%。隨著市場對生物制藥需求增長，2017 年全球處方藥銷售額超 1 萬億美元，重組單克隆抗體在獲批生物制藥中占重要比例，2017 年全球單克隆抗體市場規(guī)模超 1000 億美元，預計 2025 年市場價值將超 3000 億美元。

多種表達系統(tǒng)可用于生產(chǎn)重組抗體，大腸桿菌適合生產(chǎn) Fab 分子，但用于治療的重組單克隆抗體需精確的翻譯后修飾，因此多在哺乳動物細胞中生產(chǎn)。CHO 細胞因具有與天然抗體相似的結(jié)構(gòu)和功能、抗人類病毒、外源基因整合穩(wěn)定等優(yōu)勢，成為生產(chǎn)治療性重組單克隆抗體的首選，目前約 75% 相關科研成果基于此細胞。經(jīng)過多年發(fā)展，CHO 細胞生產(chǎn)重組單克隆抗體的技術(shù)不斷進步，當前批式培養(yǎng)產(chǎn)量可達約 1g/L，補料分批培養(yǎng)產(chǎn)量在 1 - 10g/L。

二、提升產(chǎn)量的策略

（一）表達載體構(gòu)建策略

表達載體對 CHO 細胞中異源重組單克隆抗體表達至關重要，可通過以下方式優(yōu)化：

啟動子：常用啟動子包括 SV40、CMV 立即早期啟動子和 EF - 1α，其中EF - 1α 啟動子活性最高，對其進行修飾可提高抗體產(chǎn)量。

5′ - 非翻譯區(qū)（5’ - UTR）：Hsp70 mRNA 的 UTR 中存在增強翻譯的元件，優(yōu)化 5′ - UTR 的 RNA 結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達水平。

內(nèi)含子：研究發(fā)現(xiàn)，SV40 內(nèi)含子在瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染條件下，均可顯著提高轉(zhuǎn)基因表達和重組蛋白產(chǎn)量。

信號肽：利用小鼠 IgGκ 信號肽可高效生產(chǎn) CYTL1 蛋白，優(yōu)化重鏈和輕鏈信號肽有助于提高治療性抗體表達效率。

密碼子優(yōu)化：將抗體可變區(qū)密碼子替換為人類天然抗體基因的偏好密碼子，可使抗體表達水平提高 2 - 3 倍。

此外，還有多種載體設計策略，如單順反子載體、雙啟動子表達載體和雙順反子載體（由內(nèi)部核糖體進入位點 IRES 或 Furin - 2A 介導） 。雙順反子載體可使輕鏈和重鏈在單個 mRNA 中共同表達，其中Furin - 2A 介導的雙順反子載體在瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染條件下，抗體表達水平顯著高于 IRES 介導的載體。

（二）瞬時表達優(yōu)化

瞬時表達在哺乳動物細胞生產(chǎn)重組蛋白中應用廣泛，但存在物理化學障礙。在 CHO 細胞生產(chǎn)重組單克隆抗體時，雙順反子載體和雙啟動子載體的表達水平高于單順反子載體，且輕鏈表達水平對抗體產(chǎn)量影響顯著。通過降低溫度、添加補料、共表達核苷二磷酸激酶 - A、整合 Epstein - Barr 核抗原 - 1 及 oriP 元件等方法，可提高瞬時表達效率和抗體產(chǎn)量。

（三）穩(wěn)定細胞株的建立與篩選

篩選穩(wěn)定高產(chǎn)細胞株是生產(chǎn)重組蛋白的關鍵，常用基于抗生素（如嘌呤霉素 PURO 和殺稻瘟菌素 BSD）的篩選系統(tǒng)。此外，piggyBac 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)和人工染色體表達（ACE）系統(tǒng)等新方法也可用于高效建立穩(wěn)定細胞株。優(yōu)化抗體工程，調(diào)整重鏈 / 輕鏈多肽比例，可減少聚集，提高抗體表達和產(chǎn)品質(zhì)量。

三、生產(chǎn)過程中面臨的挑戰(zhàn)

抗體聚集：抗體聚集體可能引發(fā)免疫反應，其形成受氨基酸序列、細胞系特性等多種因素影響，低溫培養(yǎng)可能增加聚集。可通過添加海藻糖、共表達伴侶蛋白等策略減少聚集。

翻譯后修飾問題

• 糖基化：是重組單克隆抗體最常見的翻譯后修飾，不同糖型影響抗體生物活性和治療特性，去糖基化的重組單克隆抗體更適合治療。

• 羥基化：重組單克隆抗體中賴氨酸殘基可能發(fā)生羥基化，推測與 CHO 細胞中類似賴氨酰羥化酶復合物的活性有關。

其他挑戰(zhàn)：還包括遺傳不穩(wěn)定性（表觀遺傳和基因拷貝數(shù)變化）、片段化（宿主細胞蛋白酶導致）、二硫鍵還原、甲硫氨酸氧化和移碼突變等問題，均會影響抗體質(zhì)量和生產(chǎn)。

四、影響重組單克隆抗體產(chǎn)量的因素

除 CHO 細胞自身特性外，多種因素影響重組單克隆抗體產(chǎn)量，如2 - 氨基嘌呤、蛋白激酶 R、核糖核酸酶 L、作用于 RNA 1 的腺苷脫氨酶、Bcl - xL 蛋白、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的表達，以及溫度、5’ - 非翻譯區(qū)和3’ - 非翻譯區(qū)等，這些因素在瞬時和穩(wěn)定表達中的影響機制有待進一步研究。

五、結(jié)論

CHO 細胞在重組單克隆抗體的科研和工業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)主導地位，未來仍將發(fā)揮重要作用。通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方、改進表達載體、探索細胞工程技術(shù)等，CHO 細胞生產(chǎn)重組單克隆抗體的能力將不斷提升，以滿足日益增長的市場需求和多樣化的應用場景。

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