肝纖維化是世界性的健康挑戰。肝纖維化導致細胞外基質的過度沉積，形成纖維狀的疤痕組織，從而擾亂肝臟的正常生理結構。在長期的慢性損傷過程中，肝纖維化會逐漸進展為肝硬化，進一步發展至肝臟功能衰竭 或誘發肝細胞癌。肝纖維化的大多數致死發生于晚期。 因此闡明早期肝纖維化如何進展為肝硬化的機理可啟發新型治療思路和手段，具有重要臨床 意義。

臨床上對肝纖維化的各類分期標準均與膠原蛋白在肝小葉的沉積模式相關。其中， Metavir 和另外 3 種肝纖維化分期評分體系(圖1)均表明，早期膠原沉積主要呈點狀在匯管區 (portal tracts) 附近分布，在 晚期會 出現 “ 匯管區到匯管區 ” (portal to portal) 的方向性分布，產生 “ 纖維間隔 ” (Septa) ， 然而如何產生這種方向性膠原蛋白分布的機制尚不明確。

圖1臨床常用肝纖維化分期體系中早期和晚期膠原蛋白的空間分布具有方向性

2025 年 5 月 23 日 ，清華大學生物醫學工程學院教授、清華 - 北大生命聯合中心研究員杜亞楠團隊 在 Nature Biomedical Engineering 期刊發表題為

Tension

- induced

Directional

Migration

of

Hepatic

Stellate

Cells

Potentially

Coordinate

Liver

Fibrosis

Progression

目前大部分肝纖維化體外模型缺乏肝小葉結構。尚 不能重現肝纖維化進程中膠原蛋白的方向性分布和 “ 纖維間隔 ” 。研究團隊制備了具有肝小葉結構的體外模型， 探究生物力學對肝纖維化進程中方向性膠原沉積的調控作用。

跨尺度的系統研究 ( 圖 2) 。

? 器官尺度上：在小鼠肝纖維化模型中，解析表征了 “ 匯管區到匯管區 ” 具有方向性的膠原沉積和肝星形細胞分布

? 組織尺度上：首次構建具有肝小葉結構的肝纖維化體外模型，可重現體內肝纖維化進程中肝星形細胞和膠原方向性分布和纖維間隔的形成

? 細胞尺度上：使用體外膠原拉伸系統，模擬肝纖維化模型中重塑膠 原產生 的應變，發現肝星形細胞在 “ 重塑膠原 ” 上呈現方向性遷移，其遷移速度和細胞激活狀態與應變大小均相關

? 分子尺度上： 證明力響應蛋白 LIMD1 的液 - 液相分離參與了對細胞方向性遷移的調控

本研究使用四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化體內模型，表征早期和晚期的病理特征。肝星形細胞是肝纖維化進程中的主要效應細胞，可大量分泌膠原導致其沉積。研究發現，在肝纖維化早期， 靜息態肝星形細胞 在肝小葉中呈現彌散性分布， 激活態肝星形細胞 在匯管區附近聚集；在肝纖維化晚期， 靜息態肝星形細胞 部分在匯管區附近聚集，而 激活態肝星形細胞 與重塑膠原同時形成了“匯管區到匯管區”的方向性分布（形成纖維間隔）。本研究構建了一種基于 微組織 加工技術的體外仿生“肝小葉”模型，能夠重現這種膠原和肝星形細胞的分布趨勢和動態變化。

為了模擬肝小葉的六邊形結構，研究設計和制作了一種微型 PDMS ( 聚二甲基硅氧烷 ) 印章。這種制備方法結合了加工深度高但分辨率低的激光雕刻技術，以及加工深度低但分辨率高的光刻蝕技。這種 PDMS 印章使用時的方法類似在紙上蓋章。在細胞沉降到印章內的孔狀結構后，可以轉印到膠原蛋白上，以形成模擬肝纖維化早期細胞分布的體外模型，即 激活態肝星形細胞 在匯管區域聚集， 靜息態肝星形細胞 彌散分布于肝小葉中 。

由于巨噬細胞在肝臟纖維化進程中具有重要調控作用，本研究也嘗試將具有 M1 極化表型的巨噬細胞加入到該 微組織 模型中進行共培養，并觀察到其對肝纖維化進展可產生一定的抑制作用。

接下來探究了在肝纖維化體外模型中，調控細胞分布是否有生物力學因素的參與。利用激光微切割技術，發現平行于“匯管區到匯管區”方向切割時，膠原蛋白不會張開；但如果是垂直方向的切割，則會有明顯張開。提示在“匯管區到匯管區”方向上存在張力，并且先于細胞形成“匯管區到匯管區”的條帶狀定向分布。

在激光切割后培養過程中發現，不切割和平行于“匯管區到匯管區”方向切割后，“匯管區到匯管區”的細胞條索狀分布仍可出現。但如果是垂直方向的切割，細胞分布則會出現“匯管區到切口邊緣”的現象，和有限元分析中的張力分布模擬結果相符 。該結果進一步提示，張力是肝纖維化體外模型中激活態星形細胞產生“匯管區到匯管區”方向性分布的主要原因。

接下來，為了精確探究張力、膠原蛋白和細胞之間的相互作用，設計了一種能適配共聚焦成像的拉伸裝置，系統探究了膠原蛋白在受到仿生應變后的應力增強 (stiffening) 和定向排列 (alignment) 等特征變化 。

在將這種拉伸裝置微型化后，可與活細胞工作站適配，系統表征了肝星形細胞在拉伸后“重塑膠原”上的遷移特性。 靜息態肝星形細胞 隨著應變增加，遷移速度先上升后下降，而 激活態肝星形細胞 的遷移速度不受應變的調控。同時靜息態和激活態細胞，在拉伸強度增加后，遷移方向都會向拉伸方向偏移 。潛在解釋了張力分布調控的膠原重塑以及靜息態 / 激活態肝星形細胞 的動態分布特征。

最后探究了細胞在膠原蛋白上定向遷移中可能參與的分子機制。方向性的物理信號通過與膠原蛋白結合的整合素 (integrin) 傳遞到細胞膜內，激活了與整合素結合的力響應蛋白 LIMD1 的液 - 液相分離 (liquid-liquid phase separation) ，使其產生局部聚集，募集了更多的黏著斑組件和肌動蛋白相結合，促進了細胞在張力方向上的定向遷移。該機制進一步得到基于免疫熒光染色、熒光猝滅后恢復實驗和敲除實驗結果的驗證。

綜上，本研究通過制備具有肝小葉結構的肝纖維化體外模型，提出并驗證了可解釋肝纖維化早期和晚期中細胞和膠原方向性分布的潛在機制：即分布在匯管區的激活態肝星形細胞通過產生張力，導致膠原蛋白發生應力增強和定向排列。其中應力增強效應使彌散在肝小葉中的 靜息態肝星形細胞 更傾向于遷移并駐留在匯管區附近，從而在晚期出現部分聚集。而定向排列效應使 激活態肝星形細胞 沿張力方向遷移，從而出現“匯管區到匯管區”的方向性分布，形成“纖維間隔”(圖3)。本研究對揭示肝纖維化進展機制和開發潛在的新型干預療法具有重要價值。

圖 3 肝纖維化進展中細胞產生的張力如何調控膠原重塑和細胞分布的總結性機制

清華大學生物醫學工程學院教授、清華 - 北大生命聯合中心研究員杜亞楠為該文章的通訊作者，清華大學 生命科學學院博士周律為第一作者，醫學院博士生石子 敖 、航空航天學院本科生楊學思、生物醫學工程學院博士生曾佳楠、尤志峰、醫學院博士生張鈺瑩、多倫多大學朱芷玥、醫學院博士生劉志強、醫學院博士生牛宇迪、醫學院碩士生于鴻升、生命學院博士生何金亮對本研究有重要貢獻。北京大學基礎醫學院系統生物醫學研究所吳聰穎教授對本研究有重要指導。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-025-01381-0

制版人： 十一

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