（文末可查看目錄）

免疫組織化學（immunohistochemistry, IHC）是利用抗原抗體反應以顯示某蛋白的表達及定位的實驗。這種實驗的獨特之處在于它既直觀地顯示了蛋白在組織及細胞或細胞亞結構的定位，又保留了組織樣品的結構特征。IHC 已廣泛應用于生物醫學研究及臨床診斷中。

目前免疫組化尚無統一的標準計量方法，但已有幾種公認的 IHC 計量方法，你真的知道該如何選擇嗎？下面我來一一詳細介紹，小伙伴們趕緊收藏轉發啦～

一、積分制

積分制是對切片以細胞染色強度、陽性細胞范圍進行評分，再相乘得出最終得分的方式，這是最常用的方法。

標準評分為：

根據細胞染色強度評分為 4 級

• 無陽性著色（陰性）計 0 分

• 淡黃色（弱陽性）計 1 分

• 棕黃色（陽性）計 2 分

• 棕褐色（強陽性）計 3 分

根據陽性細胞百分比評為 4 級

• ≤25% 計 1 分

• 26%-50% 計 2 分

• 51%-75% 計 3 分

• ＞75% 計 4 分

將兩項評分相乘得出最終評分結果 [1-2]。

此種方法是最貼近臨床方面的，小伙伴們如果想做某因子的臨床病理特征分析，那最好采用這種方法。

二、陽性細胞數

計數陽性細胞數適用于評估某物質是否在組織中存在以及數量，是對該物質數量而不是表達強弱的判別。

如評估某細胞在該組織中的數量，可利用該細胞的特異性標志物做免疫染色。如 CD163 標記 M2 型腫瘤相關巨噬細胞，CD34 標記血管內皮細胞，CD3 標記 T 細胞等等。

對于這類免疫組化，我們直接計數 20 倍鏡下隨機 5 個視野下的陽性細胞數，再求一個平均數即為這張片子的陽性細胞數。

也有計算單位面積下陽性細胞數的方法。通過統計 20 倍鏡下的細胞數，在除以鏡下面積，得出細胞密度，單位為 cells/mm2。

三、Image Pro Plus 軟件測量平均光密度值

有時，我們想定量的分析某因子的高低表達差異，用半定量的積分制并不能很好的區分差異，我們可使用軟件進行統計分析。

Image Pro Plus 軟件的計量原理是根據目的蛋白的著色深淺及分布面積來確定目的蛋白的表達量。

通過測量出每張圖片的累積光密度值（integrated option density, IOD）值以及區域面積 area 值，再計算出平均光密度值（mean density）即 mean density=IOD/area，此值反映了目標蛋白的單位面積濃度。最后取每個樣本的 5 個隨機區域 mean density 的平均值即為此樣本的值。

下面我們以分析免疫組化圖片為例講解 IPP 軟件的操作步驟（假設粉紅色未陽性表達區域）。

第一步：處理圖像

我們分析的是免疫組化的圖片，所以先要把圖像 intensity 格式。在默認的 intensity 格式中，是圖片灰度，越黑數值越小，越白數值越大。而實際上我們測量的染色強度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不進行光密度單位的轉換，測量的數值將完全相反的。

方法：measure - calibration - intensity，然后在窗口中點 new 按鈕，再點一下下面的 std optical density 選項，這時可以看到窗口中的直線變成了反向的曲線。

然后點 system - close（IPP 功能多，建議每次都檢查，如果中途不再進行別的功能，打開軟件后只要操作一次就行，不用每張圖片都操作）

第二步：顏色選取

明確一個概念 AOI（area of interest），即感興趣的區域，也是我們觀察的重點，也就是我們說的免疫組化陽性表達區域。這里我只介紹入門級的 2 種選擇方法：吸管工具和 HIS 顏色選擇系統。

先介紹吸管工具：

點擊 measure---count/size，跳出如下界面。

點擊 Select Colors，顯示如下。

點擊吸管工具，在圖片上選取 AOI（可以反復點擊，直到你覺得所有陽性表達都被選中，當然吸管工具右側，有撤銷，橡皮擦等修改工具）。

經過多次點擊，假設現在所有陽性表達都已經被選中，那么 AOI 選取結束。

下面介紹 HIS 系統選取顏色：

在 HSI 顏色格式中，H 為色調，就是我們眼睛所看到的紅橙黃綠青藍紫等。S 為色飽和度，I 為強度。在選擇 AOI 時，首先保持 S、I 為最大范圍，從 H 中選擇粉色部分。使用這個顏色格式的好處是，選擇的顏色能包括這種顏色的不同深淺及亮度。

顏色選擇好了后，就可以分析了。

*強烈推薦一個功能：點擊左下角 File – save file 將此顏色信息保存，下一張圖片可以調用此文件，從而減少操作誤差，也簡化了步驟。

第三步：分析

選擇分析參數：免疫組化常見的幾個參數（意義不多解釋，可自行搜索）

• area 面積

• density（mean）平均光密度

• diameter 直徑

• IOD（integrated optical density）累積光密度

顏色選好后回到先前界面，點擊 Measure-select Measurements 進入選擇測量參數，最常用的四個參數已如上述。

這里再介紹一點，可設置范圍（上圖中間靠下）：每一個陽性表達區域都是有大小的，如圖可以將小于 10 的陽性表達區域舍棄不計算，這個可以根據自己實際情況調整，但一般取默認值。點擊 OK，回到原先界面點擊 Count，得出結果得出結果（View - Statistics）：

第四步：整理數據

File - Export Data 整理

相信，這樣簡單介紹后能用 IPP 處理一些簡單的免疫組化的圖片數據。

好了，以上為 3 種免疫組織化學常用的計量方法，希望對大家免疫組化實驗數據處理有所幫助，少走彎路。

具體選擇哪種方法還是要根據你的研究內容和目的，最后祝大家早日發 SCI 呀～

我們長期為科研用戶提供前沿資訊、實驗方法、選品推薦等服務，并且組建了 70 多個不同領域的專業交流群，覆蓋PCR、細胞實驗、蛋白研究、神經科學、腫瘤免疫、基因編輯、外泌體、類器官等領域，定期分享實驗干貨、文獻解讀等活動。