α-L-

巖藻糖苷酶是一類重要的糖苷水解酶，能選擇性地水解或轉移糖或糖綴合物中的非還原性

α-L-

巖藻糖基殘基。通常，基于氨基酸序列相似性和催化機制，在碳水化合物活性酶數據庫中將

α-L

-巖藻糖苷酶分為GH151、GH95和GH29家族。其中，GH29家族生物來源廣泛，部分成員展現出轉糖基活性，近年來受到越來越多的關注。

GH29家族的

α-L-

巖藻糖苷酶主要通過保留機制水解

α-L-

巖藻糖基殘基。此外，基于底物特異性和系統發育關系，GH29家族的

α-L

-巖藻糖苷酶可進一步分為兩個主要亞家族：GH29A和GH29B。GH29A

α-L-

巖藻糖苷酶通常具有相對寬松的底物特異性，能夠作用于多種底物，而GH29B巖藻糖苷酶則表現出更為專一的底物特異性，主要作用于

1-3/4巖藻糖苷鍵。

近年來，國內外學者在多個領域集中研究

α-L-

巖藻糖苷酶，包括其對母乳低聚糖的利用、酶法合成母乳低聚糖、優化酶的生產條件以及酶分子的改造等。

東北農業大學食品學院的李巧慧、溫淼、孟祥晨*等實驗借助計算機輔助的酶挖掘和鑒定技術，研究源自鼠李糖乳酪桿菌（LGG）的巖藻糖苷酶

AlfB

。通過生物信息學分析，探討其結構性質及催化機制，并構建能夠表達

AlfB

的重組工程菌株

Escherichia coli

BL21（DE3），通過優化參數，以實現該酶的高效異源表達。此外，還深入探討該酶的酶學性質，特別是對2’-FL的水解及其轉糖基特性，以期為深入研究GH29家族對2’-FL及其結構類似物的催化機制提供參考。

1 重組大腸桿菌菌株的構建及驗證

LGG中

α-L-

巖藻糖苷酶

AlfB

基因的開放閱讀框長度為1 272 bp，編碼含423 個氨基酸殘基的蛋白。本實驗選擇含有雙T7啟動子的高拷貝外源表達載體pETDuet-1，以實現巖藻糖苷酶高效表達。

將提取出的LGG的DNA基因組通過引物擴增得到目的基因，克隆結果如圖1a所示。結果表明，1號泳道產物與理論PCR產物大小1 272 bp相符，說明目的基因擴增成功。將目的基因與質粒pETDuet-1連接，利用菌落PCR篩選陽性克隆子，得到重組質粒pETDuet-1-AlfB，驗證結果如圖1b所示，1～3泳道條帶與預期產物大小1 272 bp接近，表明重組質粒成功轉入

E. coli

DH5

中。重復上述實驗得到重組質粒pETDuet-1-AlfB2，驗證結果如圖1c所示。之后將重組質粒pETDuet-1-AlfB2轉化至

E. coli

BL21（DE3）表達宿主中進行表達，挑選陽性轉化子初步發酵并測定酶活性。結果表明，細胞裂解液可以使以

p

NPFuc為底物的溶液變黃，說明產LGG中的

α-L-

巖藻糖苷酶

AlfB

的工程菌株構建成功。

2

α-L-

巖藻糖苷酶

AlfB

生物信息學分析

2.1 蛋白基本理化性質

運用Protparatam在線生物軟件預測LGG基因編碼的

AlfB

蛋白的理化性質，結果顯示，其分子式為 C 2167 H 3 276 N576O621S11，蛋白質的分子質量為47 kDa，等電點為5.89。在氨基酸的構成中，相對含量較多的氨基酸為Ala（丙氨酸）、Leu（亮氨酸）、Gly（甘氨酸）、Val（纈氨酸）和Asp（天冬氨酸），分別占9.5%、8.3%、7.8%、7.3%和6.1%。帶負電荷的殘基（Asp+Glu（谷氨酸））數量為51，帶正電荷的殘基（Arg（精氨酸）+Lys（賴氨酸））數量為41。該蛋白脂溶指數為85.11，表明該蛋白是脂溶性蛋白，總親水性平均系數為－0.244，表明該蛋白為親水性蛋白。

2.2 蛋白信號肽、跨膜結構與親/疏水性分析

Protscale分析蛋白親/疏水性表明，AlfB蛋白最大親水性區域位于第42號氨基酸（疏水性得分－2.889），最大疏水性區域位于109號氨基酸（疏水性得分2.189）（圖2），整體來看，親水性殘基數多于疏水性殘基，進一步表明該蛋白在水相環境中具有較高的溶解性。Deep TMHMM 1.0分析表明

AlfB

蛋白為非跨膜蛋白；利用SignalP 5.0軟件預測信號肽時，結果表明其不存在信號肽。

2.3 蛋白二級結構及三級結構分析

AlfB

蛋白二級結構由

α-

螺旋、延伸鏈和無規卷曲組成。其中

α-

螺旋占25.77%，延伸鏈占18.44%，無規卷曲占55.79%；利用SWISS-MODEL同源建模（圖3a）結合InterPro數據庫分析，結果發現，

AlfB

為單結構域酶，整體結構由 N 端TIM桶狀GH29催化結構域以及通常被假設為碳水化合物結合模塊組成，TIM桶狀催化結構域表現出典型的（

β/α

）8 排列，保守結構域位于4-310號氨基酸，拉氏圖（圖3b）分析結果顯示，有90.8%氨基酸殘基落在允許區和最大允許區，表明蛋白三維模型構建較為成功。

2.4 同源蛋白氨基酸序列比對及分子對接分析

基于

AlfB

與2’-FL的分子對接，結合系統發育樹、同源氨基酸序列比對分析（圖4），結果表明，LGG中的

AlfB

屬于GH29A家族。該酶與2’-FL對接結合能為－8.2 kcal/mol，說明相互作用是自發的且具有強結合活性，底物結合口袋的氨基酸多為親水性氨基酸，氫鍵是穩定

AlfB

-2’-FL復合物的主要作用力。在

AlfB

與2’-FL的相互作用中，有兩個保守的活性位點位于與底物結合的催化口袋，分別是Asp166和Glu32。在

α-L-

巖藻糖苷酶的催化過程中，Asp和Glu分別作為親核催化位點和酸堿催化位點。然而，酸堿催化位點Glu并非在所有GH29

α-L-

巖藻糖苷酶中都是保守的。

3

α-L-

巖藻糖苷酶

AlfB

的異源表達條件優化及其純化

大腸桿菌表達系統中，溫度對重組蛋白的表達、折疊和活性有顯著影響。如圖5a所示，在20～40 ℃之間，相對酶活力呈現先上升再下降的趨勢。當誘導溫度為25 ℃時，蛋白含量最高，重組菌酶活力達到最大值，為（29.34±0.20）U/mL（表2）。超過25 ℃后，隨著誘導溫度的繼續升高，重組菌相對酶活呈現下降趨勢，在誘導溫度為40 ℃條件下，酶活力降至18.56 U/mL。

誘導時間是大腸桿菌表達外源蛋白的另一個重要影響因素。如圖5b所示，隨著誘導時間的延長，重組酶的相對酶活力呈現先上升后下降的趨勢，在4～16 h重組酶相對酶活力升高幅度較大，說明重組蛋白表達量不斷提高，在16～28 h重組酶的相對酶活升高的較為緩慢，在28 h時，酶活力達到最大值，為（29.94±0.55）U/mL（表3）。

經過優化，確定最佳誘導條件為誘導溫度25 ℃和誘導時間28 h。在此條件下，成功誘導表達了N端帶有His標簽的重組

α-L-

巖藻糖苷酶

AlfB

。如圖6中泳道2所示，經過純化后，洗脫液在47 kDa處出現了一條明顯的條帶，與氨基酸序列預測的分子質量一致。以純化后的重組酶

AlfB

為研究對象，采用Bradford法測定其蛋白質量濃度為1.46 mg/mL。

4

AlfB

酶學特性分析

4.1 最適溫度及熱穩定性分析

溫度通過改變酶分子的空間構象，從而影響其催化活性。如圖7所示，在最適溫度方面，在25～35 ℃范圍內，相對酶活力隨著溫度的升高而增強；而在35～45 ℃范圍內，相對酶活力的降低速度相對緩慢，表明該酶具有一定的耐熱性。然而，當溫度超過45 ℃時，相對酶活力迅速下降，在65 ℃時，相對酶活力僅保留不足15%。因此，重組AlfB的最適反應溫度為35 ℃。在熱穩定性研究中，該酶在25～50 ℃之間的活性相對穩定，而在50～65 ℃之間波動幅度較大，進一步表明該酶具有一定的耐熱性。

4.2 最適pH值及pH值穩定性分析

pH值的變化會引起蛋白質基團及其空間結構的變化，影響酶-底物中間復合體的形成以及催化活性部位的電離狀態，從而影響酶的活性。如圖8a所示，在pH 4.0～6.0范圍內，該酶的催化活性隨著pH值的升高而增加，但在pH 6.0之后，活性則開始下降，推測重組酶的最適反應pH值為6.0。圖8b顯示了重組酶的pH值穩定性，當pH在6.0～8.0之間時，酶活性相對穩定；當pH值為9時，經過4 h反應后，其相對酶活力不足15%。

4.3 金屬離子對酶活性的影響

金屬離子可以作為催化劑或輔因子，通過增強酶的穩定性和影響底物的親和力，最終對酶的催化效率產生影響。如圖9所示，與對照組相比，在2.5 mmol/L的金屬離子溶液中，Mn2+對重組酶的催化反應具有激活作用，重組酶的相對酶活力最高，達到225.25%；Cu2+對重組酶的催化反應具有抑制作用，相對酶活力最低，僅為1.97%。此外，相較于無金屬離子溶液處理，一價金屬離子處理后，對重組酶相對酶活力均有不同程度的抑制作用；二價金屬離子溶液處理（除Cu2+外）對重組酶相對酶活力均有促進作用，其影響大小順序為：Ca2+＜Mg2+＜Mn2+。

5

AlfB

水解2’-FL活性及轉糖基活性分析

在本研究中，首先測定了

AlfB

在以2’-FL為底物條件下的水解產物。結果顯示，反應生成了游離的巖藻糖，這進一步支持了GH29A家族

α-L-

巖藻糖苷酶主要通過保留機制水解2’-FL中的

1-2巖藻糖苷鍵。為了驗證

AlfB

合成2’-FL的可行性，在酶水解pNP-Fuc的最佳條件下（35 ℃、pH 6.0）進行轉糖基反應，以確保過量巖藻糖基殘留物的存在，并同時加入500 mmol/L乳糖作為巖藻基殘基的受體。采用ESI-MS法對

AlfB

的轉糖基化產物進行了檢測，轉糖基化產物的總離子流在0.75 min左右有較強的響應值，這與2’-FL標準品一致（圖10a），ESIMS譜顯示在

m/z

506.1處出現了一個[M+NH 4] 2+ 離子峰（圖10b），該值與2’-FL及其異構體3’-FL的相對分子質量（488.4）一致，說明該酶具有轉糖基特性。

2’-FL和

p

NP-Fuc分別是

AlfB

水解及轉糖基作用底物，圖11為

AlfB

反應動力學曲線，酶動力學分析結果（表4）顯示，

AlfB

在以2’-FL為底物時表現出更高的最大反應速率（V max ）和更低的米氏常數（

K

m ），說明其在以2’-FL為底物條件下具有更高的催化效率和底物親和力。

6 討論

酶的高效表達對工業化生產意義重大，使用雙啟動子表達系統對基因過表達是一種普遍且有效的方法，本研究中通過構建含雙T7啟動子的重組表達載體和優化誘導條件，以增加目的蛋白的產量，經過優化，確定在25 ℃條件下誘導28 h誘導效果最佳。誘導溫度為20 ℃時，由于溫度較低，減緩細胞的代謝活動和轉錄、翻譯過程，導致蛋白質的表達水平不佳；當溫度升至25 ℃，此時有利于重組巖藻糖苷酶蛋白質的正確折疊，更有利于重組蛋白的積累。通常認為溫度高于30 ℃時不利于重組蛋白表達，這可能由于溫度過高蛋白質在表達過程中錯誤折疊，形成包涵體，進而影響其功能和純化效果。當誘導時間小于28 h時，酶活力偏低，這可能是由于誘導時間過短，導致重組蛋白積累量不足。隨著誘導時間的進一步延長，重組酶活力開始下降，這可能是因為長時間誘導會對細胞造成較大的代謝負擔，影響細胞的生長和存活，進而降低表達效率。此外，長時間的誘導也可能導致蛋白質降解，從而減少最終產量和活性。

經SDS-PAGE分析，

AlfB

的表觀分子質量為47 kDa，與預測的分子質量相匹配。重組蛋白

AlfB

的分子質量與來自地桿菌（

Pedobacter

sp. CAU209）的

Pb

Fuc（50 kDa）、來自長雙歧桿菌（

Bifodobacterium longum

）的Blon_0426（50.3 kDa）和來自海棲熱袍菌（

Thermotoga maritima

）的

α-L-

巖藻糖苷酶（50.7 kDa）相似。

AlfB

的最適溫度為35 ℃，與來自地桿菌的PbFuc最適溫度相同，高于來源于海洋

Flavobacterium algicola

12076的OUCJdch16（25 ℃），這可能與其來源于腸道環境有關。與雞糞腸球菌（

Enterococcus gallinarum

ZS1）來源的EntFuc相比，

AlfB

具有較強的熱穩定性。純化的

AlfB

在pH 6.0的磷酸鹽緩沖液中表現出最高的水解活性，對強酸性和強堿性反應條件比較敏感，這可能是由于強酸或強堿環境影響了重組酶的空間結構，使其無法與底物充分結合，導致活性降低。實驗數據表明，

AlfB

在弱酸性環境下具有最高的水解活性。不同金屬離子溶液會對重組酶產生激活或抑制作用，Cu 2+ 對

AlfB

的抑制作用最為明顯，這與其他來源的

α-L

-巖藻糖苷酶一致，這是由于不同金屬離子與酶活性中心位點的螯合能力及方式的差異有關。Mn 2+ 對

AlfB

的激活作用最顯著，在以往的研究中，Mn 2+ 對同為糖苷水解酶家族的

PbFuc

BcFucA

同樣表現出激活作用，在其他外源蛋白表達相關研究中也存在著類似的情況，例如高山被孢霉（

Mortierella alpina

）來源的異檸檬酸脫氫酶在以Mn 2+ 作為輔因子時，其酶活性最大。這可能是由于這種金屬離子的靜電引力和半徑大小更有利于酶與底物之間形成環狀金屬橋結構，金屬離子更有利于基團之間的相互作用。

GH29A家族的

α-L-

巖藻糖苷酶能催化

α-

1,2巖藻糖苷鍵的形成。在目前的研究報道中，多數該家族的

α-L

-巖藻糖苷酶能夠水解和轉巖藻糖基化合成2’-FL。基于分子對接技術，發現該酶與2’-FL具有強結合活性，底物結合口袋的氨基酸多為親水性氨基酸，這種現象可能是水解反應涉及水分子的參與，親水性氨基酸的極性特征有助于增強與底物和水分子的相互作用，從而提高催化效率。此外，經過蛋白序列比對分析結果表明，該酶在水解2’-FL的活性中心中存在兩個保守的催化位點，即Asp166和Glu32。綜合以上分析，預測該酶通過保留機制完成水解反應。首先，酶催化的第一步反應為糖基化反應，其中Asp166的羧基直接對底物2’-FL的異頭碳發動親核攻擊，從而形成

AlfB

-2’-FL復合物，在此過程中，Glu32的羧基通過酸催化提供質子，幫助離去基團離去。催化反應的第二步為去糖基化反應，此時Glu32進行堿催化，促使水分子對

AlfB-

2’-FL復合物進行攻擊，進而發生水解反應。在一部分GH29A酶家族中，當受體分子為糖或者其他含有羥基的化合物時，有可能發生轉糖基反應。

在以乳糖及pNP-Fuc作為底物條件下，通過液相色譜-質譜聯用儀檢測轉糖基化產物，確定了

AlfB

能夠合成2’-FL的可行性。接著對

AlfB

的轉糖基作用底物pNP-Fuc以及水解作用底物2’-FL通過酶動力學參數比較發現，

AlfB

對2’-FL親和能力更強，這與目前報道的

α-L-

巖藻糖苷酶轉糖基化反應產率較低原因一致，目標產物易被

α-L-

巖藻糖苷酶水解。

7 結論

本研究對LGG中的關鍵

α-L-

巖藻糖苷酶

AlfB

實現了高效表達，重組

AlfB

的最適溫度為35 ℃，最適pH值為6.0，在50 ℃以下具有較好的穩定性。重組酶

AlfB

能夠在以乳糖及pNP-Fuc作為底物條件下，通過轉糖基化反應合成2’-FL，在對重組

AlfB

水解及轉糖基作用底物親和能力比較發現，

AlfB

對2’-FL親和能力更強，其水解2’-FL的活性中心中兩個保守的催化位點為Asp166和Glu32。以上結果可為深入研究2’-FL結構及其類似物的水解及合成機制提供參考，后續可通過分子改造提高

AlfB

的轉糖基活性以及降低水解活性，進而提高酶法合成2’-FL的產量。

作者簡介

通信作者：

孟祥晨，教授，博士生導師，食品發酵工程二級學科帶頭人，乳品科學教育部重點實驗室乳品微生物及生物技術平臺負責人。愛爾蘭科克大學（UCC）訪問學者，美國猶他州立大學高級訪問學者。中國畜產品加工研究會常務理事，國家食品藥品監督管理局食品安全專家，中國奶業協會理事，農業農村部農產品加工標準化技術委員會委員，《中國釀造》《乳業科學與技術》雜志編委；國際、國內數十種學術期刊審稿人。中國農學會青年科技獎獲得者，畜產品加工研究會駱承庠基金優秀青年教師獎獲得者。主要從事乳品科學與技術、食品微生物與生物技術、食品發酵等領域的教學和科研工作。先后主持、參加國家自然科學基金、教育部創新團隊、“863”項目、國家科技支撐計劃、省市級各類課題20余項，獲各級各類獎勵8項。獲授權專利10余項，轉讓科技成果3 項。出版專著和教材10余部，發表學術論文200余篇，其中SCI和EI收錄50余篇。

第一作者：

李巧慧，現就讀于東北農業大學食品工程專業，碩士研究生，研究方向為乳品生物技術、乳品微生物。

本文《

α-L

-巖藻糖苷酶AlfB的生物信息學分析、異源表達及活性》來源于《食品科學》2025年46卷第11期105-144頁，作者：李巧慧，溫 淼，于 航，蘇 倩，孟祥晨*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241111-076。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關信息。

實習編輯：劉芯；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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