文/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳昌福，武漢科研時代生物技術(shù)有限公司 周鑫軍

正文/5461字

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陳昌福有話說

最近一段時間，也許是因為我們關(guān)于在對蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物飼料中檢測到某些致病性病毒和寄生蟲基因片段的問題，發(fā)表了我們相關(guān)意見的緣故，有一些水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者來信息咨詢問題，在池塘淤泥中檢測到致病性病毒和寄生蟲的基因，是不是也沒有問題？

因為這種疑問可能對于更多的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者都是存在的。我們在撰寫的這篇小文章中，介紹了PCR檢測致病性生物的基本原理、方法以及所檢測目標(biāo)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，回答了從池塘淤泥中檢測到致病性病毒和寄生蟲的基因后，尚需要采用實驗證明這些致病性病毒和寄生蟲是否活體，如果實驗結(jié)果證明不是活體的話，就是屬于已經(jīng)失去了致病作用的遺傳物質(zhì)。希望對廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者提高對這類問題的認知水平有所幫助。

用PCR法從魚池淤泥中

檢測到病毒能說明什么？

摘要：本文介在紹了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法檢測致病性生物的基本原理、方法以及所檢測目標(biāo)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，回答了來自水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者詢問的從池塘淤泥中檢測到致病性病毒和寄生蟲的基因后，因為從池塘淤泥中檢測到的只是致病性病毒和寄生蟲的基因，還需要采用先相關(guān)實驗證明這些致病性病毒和寄生蟲是否活體？如果實驗結(jié)果證明不是活著的致病性病毒和寄生蟲的話，就是屬于已經(jīng)失去了致病作用的遺傳物質(zhì)，而僅有遺傳物質(zhì)是沒有致病功能的。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；魚池淤泥；致病性生物；遺傳物質(zhì)；致病功能

與陸生養(yǎng)殖動物相比，水產(chǎn)養(yǎng)殖動、植物的疾病，存在著病原種類眾多、傳播速度快、疾病危害大、特效藥物少、有效治療難的特點。尤其是由致病性細菌與病毒等微生物引起的傳染性疾病，其疾病的發(fā)生與流行大都具有暴發(fā)性，有效控制疾病就顯得尤其困難。因此，對于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的各種疾病，長期以來我國堅持實施的防控方針就是“以防為主，防重于治”。

為了有效地防控水產(chǎn)養(yǎng)殖動、植物的疾病，實施對能危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的致病性生物的監(jiān)測，已經(jīng)是由國內(nèi)、外的大量實踐結(jié)果證實，是防止水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病性生物擴散的重要措施，也是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部多年來，一直在支持全國水產(chǎn)科研與技術(shù)推廣單位，堅持推進的一項重要防控水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的舉措。在全國水產(chǎn)技術(shù)推廣總站帶領(lǐng)下，每年對于嚴重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的病毒性疾病，譬如主要危害草魚（

Ctenopharyngodon idella

Cyprinus carpio

Macrobrachium rosenbergii

對水產(chǎn)養(yǎng)殖動、植物致病性生物的檢測方法，最好是能具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、對痕量樣品靈敏、技術(shù)操作簡單、所需時間快捷的特點。為了尋求能達成這些目標(biāo)的檢測方法，國內(nèi)外科學(xué)工作者做出了長久的努力，直至聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法的開發(fā)成功，才堪稱是真正擁有了能準(zhǔn)確、靈敏、簡單和快捷的檢測方法。

1.用PCR檢測致病性生物的原理與方法

自從1953年，由詹姆斯·沃森（James Watson）和弗朗西斯·克里克（Francis Crick）提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，解釋了遺傳信息的存儲與傳遞機制。隨后，全世界的生物科學(xué)家利用生物遺傳信息物質(zhì)開展了生物育種學(xué)、醫(yī)學(xué)及其生物學(xué)相關(guān)的大量基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。PCR方法就是針對各種生物具有特征性遺傳信息物質(zhì)，建立起來的實驗方法。

PCR通過擴增致病性生物DNA/RNA，可以實現(xiàn)檢測結(jié)果準(zhǔn)確、對痕量樣品靈敏、技術(shù)操作簡單、所需時間短暫的特點。PCR能夠檢測極低濃度的DNA或RNA，甚至少至幾個分子，因此，PCR具有極高的靈敏度。通過設(shè)計特異性引物，PCR可以精準(zhǔn)擴增目標(biāo)序列，避免非特異性產(chǎn)物，因而具有極高的特異性。PCR反應(yīng)通常在數(shù)小時內(nèi)即可完成，特別適合需要快速得到檢測結(jié)果的樣品，因而具有需要時間短、快速獲得結(jié)果的特點。PCR技術(shù)相對簡單，實驗步驟易于被操作者熟練掌握，因此具有操作簡單的特點。總之，PCR可用于基因克隆、突變檢測、病原體檢測、遺傳病診斷等生物學(xué)相關(guān)的多個領(lǐng)域，因此具有應(yīng)用面廣的特點。

PCR法檢測致病性生物的原理是，基于DNA的擴增和特異性識別，基本步驟如下。

首先，從待檢測樣品中提取病原體的DNA，作為擴增的模板（template）。

其次，根據(jù)目標(biāo)致病性生物的特定基因序列設(shè)計引物（primer），確保特異性。

其三，加熱使目標(biāo)中并行生物的DNA雙鏈分離，此過程稱為變性。

其四，降溫使引物與目標(biāo)DNA序列結(jié)合，此過程稱為退火。

其五，DNA聚合酶以引物為起點，合成新的DNA鏈，此過程稱為延伸。

其六，重復(fù)變性、退火、延伸步驟，目標(biāo)DNA片段呈指數(shù)增長。此過程為循環(huán)擴增。

最后，通過凝膠電泳、熒光標(biāo)記等方法檢測擴增產(chǎn)物。根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小或熒光信號判斷樣本中是否含有目標(biāo)病原體。

PCR法現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用于危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的致病性病毒、細菌、真菌等病原生物的檢測，如對蝦白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）、對蝦腸肝胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）等。

2.檢測樣品要求與PCR檢測結(jié)果的判斷

采用PCR法檢測致病性生物并判斷其是否具有傳染性的時候，對于檢測樣品是具有明確要求的。在世界動物衛(wèi)生組織（office international des epizooties，OIE）牽頭制定的《水生動物衛(wèi)生法典》2012（第15版）一書中，譬如關(guān)于檢測WSSV對樣品的規(guī)定中，第9.6.3條的內(nèi)容是這樣的：從尚未宣布是無WSSVD的國家、地區(qū)或生物安全隔離區(qū)進口或運輸水生動物及其相關(guān)制品時，規(guī)定如下。

1.授權(quán)以下符合第5.3.1條之標(biāo)準(zhǔn)、第9.6.2條所涉及的水生動物及其相關(guān)制品的進口或運輸時，不管輸出國、地區(qū)或生物安全隔離區(qū)的WSSVD狀況如何，輸入國官方機構(gòu)不應(yīng)要求出口國、地區(qū)或生物安全隔離區(qū)出示任何與WSSVD相關(guān)的說明。

a．經(jīng)高溫滅菌并密封保存的甲殼動物制品（是指121℃高溫滅菌3.6min以上或可滅活WSSV的其他溫度和處理時間）。

b．經(jīng)60℃熱處理1min以上的烹制甲殼動物制品（或可滅活WSSV的其他溫度和處理時間）。

c．經(jīng)90℃熱處理10min以上的巴氏滅菌的甲殼動物制品（或可滅活WSSV的其他溫度和處理時間）。

d．甲殼動物油。

e．甲殼動物粉。

f．化學(xué)提取的甲殼素。

這些規(guī)定的內(nèi)容是非常明確的，只要是按照一定要求加工過的物質(zhì)，就不需要檢驗其中是否帶有WSSV了（也適用于其他致病性生物），不論是來自疫區(qū)還是無病區(qū)的物質(zhì)，都可以按照這個原則堆到檢測樣品。

OIE之所以規(guī)定上述樣品不宜用于檢測致病性生物，就是因為采用PCR檢測致病性生物時，是提取致病性生物的DNA制作擴增的模板，并根據(jù)目標(biāo)致病性生物的特定基因序列設(shè)計的引物，檢測樣品種只要是存在特定基因序列片段，就可以被采用的PCR方法檢測到。無論供做PCR法檢測的樣品中是否存在活著的致病性生物，只要樣品中尚存在致病性生物的遺傳物質(zhì)就可以被檢測到，因為PCR法檢測的是樣品中存在的DNA遺傳物質(zhì)。

在我國一些水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域，部分水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者為了防控水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病，將養(yǎng)殖池塘淤泥作為檢測樣品，結(jié)果PCR法從不少養(yǎng)殖池塘淤泥中，均檢測到了能危害水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病性生物所特有的DNA遺傳物質(zhì)，而且即使經(jīng)過較長的時間內(nèi)的反復(fù)檢測，都能檢測到陽性結(jié)果。正是因為總是在能檢測中能獲得陽性結(jié)果，導(dǎo)致有些水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)者長期不敢向養(yǎng)殖池塘中放養(yǎng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動、植物種苗，而耽誤了水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)季節(jié)。

利用PCR法之所以能從養(yǎng)殖池塘淤泥中檢測到某種致病性生物的DNA遺傳物質(zhì)，可能是因為在前面的養(yǎng)殖生產(chǎn)中，曾經(jīng)發(fā)生過由這種致病性生物引起的疾病或者是因為養(yǎng)殖動、植物曾經(jīng)攜帶過這種致病性生物的緣故。最后因為感染致病性生物而死亡的水產(chǎn)養(yǎng)殖動、植物沉積在池塘淤泥中，就會留下這種致病性生物的DNA遺傳物質(zhì)。

因此，由PCR法從池塘淤泥中檢測到某種致病性生物的DNA遺傳物質(zhì)后，為了要證明這種致病性生物是否具有傳染疾病的功能，就需要采用相應(yīng)的實驗方法證明這種致病性病原生物是活著的？否則，用PCR法檢測到的陽性結(jié)果就是屬于某種致病性生物的DNA遺傳物質(zhì)，是沒有傳染疾病功能的了。

投稿聯(lián)系鄭記者

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作者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳昌福；武漢科研時代生物技術(shù)有限公司周鑫軍。

編輯：鄭燕云

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