腦聲小店基于深度科研洞察，專注為動物實(shí)驗(yàn)提供"簡器械·精實(shí)驗(yàn)"解決方案。我們突破高精設(shè)備局限，開發(fā)手工定制化儀器及配件，通過科研巧思將基礎(chǔ)工具轉(zhuǎn)化為創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方案。產(chǎn)品涵蓋行為學(xué)裝置、操作輔助工具等，使實(shí)驗(yàn)室在保持操作簡效的同時，實(shí)現(xiàn)精細(xì)化數(shù)據(jù)采集，助力科研人員以創(chuàng)造性思維發(fā)掘簡易儀器的潛在科研價值。

嚙齒類動物--小鼠的本能社交行為非常依賴于嗅覺信息的引導(dǎo)。小鼠能夠通過身體外周的各種腺體，例如淚腺、生殖腺向外界分泌包含大量化學(xué)物質(zhì)的體液。這些化合物中有許多已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具備調(diào)節(jié)小鼠內(nèi)分泌活動并調(diào)節(jié)行為的功能。小鼠對嗅覺刺激的初始感知主要是來源于主嗅上皮（main olfactory epithelium，MOE）以及犁鼻器（vomero nasal organ，VNO）中的感覺神經(jīng)元。MOE的感覺神經(jīng)元主要接收飄散在空氣中揮發(fā)性小分子化合物的刺激，VNO的感覺神經(jīng)元則主要接收非揮發(fā)性的大分子物質(zhì)的刺激。同時，VNO也是小鼠探測信息素的主要嗅覺器官。嗅覺辨別能力是嗅覺功能中最基本的能力之一。

SPF級7-8周齡雄性BALB/c小鼠，體重18-22g。小鼠運(yùn)動靈活，身體勻稱，毛發(fā)干凈，無搔鼻動作及噴嚏，對外界反應(yīng)敏感。自由飲水，環(huán)境溫度18-24℃，相對濕度10%。

嗅覺障礙模型

臨用前配置3-MI溶液。3-MI溶解于玉米油中制成濃度為15mg／ml的溶液，給藥劑量為150mg／kg，給藥方式是腹腔注射。B、C組小鼠注射3-MI溶液，A組予以注射同體積的玉米油溶液。干預(yù)方法C組小鼠于建模后第1天開始行嗅覺訓(xùn)練。4種嗅素即玫瑰精油、檸檬精油、丁香精油及桉葉油醇分別取200μL和5mL蒸餾水混勻后，放入霧化機(jī)內(nèi)。B組小鼠使用蒸餾水霧化，取4組5mL蒸餾水放入霧化機(jī)內(nèi)。將霧化機(jī)的噴霧口接入小鼠籠內(nèi)，打開霧化機(jī)，每種嗅素讓小鼠持續(xù)吸入30分鐘，每天2次，共訓(xùn)練28天。期間正常飲水、攝食。A組小鼠不予任何治療措施，正常飼養(yǎng)。

動物分組與模型制備實(shí)驗(yàn)分為2組：對照組（Control）和嗅覺剝奪組（Olfactory deprivation）。選用出生后12d的C57Thy1-YFP小鼠，予氯仿40μL滴入小鼠一側(cè)鼻腔，破壞一側(cè)嗅覺復(fù)制嗅覺剝奪小鼠模型，嗅覺剝奪側(cè)腦區(qū)為嗅覺剝奪組，對側(cè)即為對照組。嗅覺剝奪1周后進(jìn)行行為學(xué)觸須視頻拍攝，如小鼠觸須功能增強(qiáng)則表明模型建立成功，主要表現(xiàn)在觸須震動的頻率、幅度或給予同一刺激強(qiáng)度觸須伸、屈的時間長短，若嗅覺剝奪后小鼠嗅覺剝奪對側(cè)的觸須震動頻率、幅度或伸、屈的時間明顯增加說明模型建立成功。

嗅覺損毀3天后，進(jìn)行嗅覺檢測，用嗅覺檢測同樣的條件和程序?qū)p毀組和對照姐進(jìn)行檢測。如果嗅覺損毀組在10分鐘內(nèi)未找到食物，記為10分鐘。損毀組10鐘內(nèi)未找到食物為損毀嗅覺成功，若遇到假陽性（小鼠在趴墊料中碰巧翻到），應(yīng)重新檢測。若檢測嗅覺未有損毀或者損毀不徹底的，應(yīng)再次損毀或者剔除。

嗅覺可恢復(fù)性損毀

使用異氟烷將小鼠進(jìn)行深度麻醉，并用25ul微量進(jìn)樣器吸取10ul的0.9%生理鹽水或者0.9%生理鹽水配制好的10%的硫酸鋅溶液緩緩滴入ICR小鼠的一側(cè)鼻腔，待小鼠清醒6h后，重復(fù)操作滴入另一側(cè)鼻腔。注：在滴鼻過程中注意小鼠處于深度麻醉過程中，以防中間清醒影響滴鼻溶液的吸入。

嗅覺剝奪對小鼠觸須功能的影響

嗅覺相關(guān)行為實(shí)驗(yàn)評估

交配行為范式

交配行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)動物雄性攻擊行為實(shí)驗(yàn)測試完成后進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始之后，將一只群養(yǎng)的激素誘導(dǎo)發(fā)情的雌性小鼠放入本地小鼠的籠子當(dāng)中，進(jìn)行30min的實(shí)驗(yàn)測試。在兩只小鼠的互相接觸活動過程中，雄性小鼠主動地嗅聞雌性小鼠的生殖器的行為被定義為“生殖器嗅聞（genital sniff）”；雄鼠從后面爬到雌鼠的背上，前爪用力抱住雌鼠的行為被定義為“騎跨行為（mount）”；當(dāng)雄鼠爬在雌鼠的背上，利用生殖器對雌鼠進(jìn)行抽插的行為被定義為“生殖器插入（intromission）”；當(dāng)雄鼠結(jié)束了生殖器的抽插，并抱住雌鼠僵硬地倒在一邊時，定義為“射精（ejaculation）”，每只實(shí)驗(yàn)小鼠將進(jìn)行兩次，2到3次的交配行為學(xué)測試，每次測試之間的時間至少間隔兩天以上，以避免射精后不應(yīng)期對小鼠行為產(chǎn)生影響。

尿液偏好

尿液偏好實(shí)驗(yàn)在單籠飼養(yǎng)的雄性小鼠籠子當(dāng)中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)開始之前準(zhǔn)備好3×3cm大小的濾紙片。對于雄性尿液偏好實(shí)驗(yàn)，在一張濾紙片上滴加50μl的雄性小鼠尿液，另外一張濾紙滴加50μl的生理鹽水作為對照。實(shí)驗(yàn)開始之后，將兩張濾紙片同時放入小鼠的籠子中，分別放在距離較遠(yuǎn)的兩個角落，小鼠對兩張濾紙片進(jìn)行5min的探索；對于雌性尿液偏好實(shí)驗(yàn)，在一張濾紙片上滴加50μl激素誘導(dǎo)發(fā)情的雌鼠尿液，另外一張濾紙片上滴加50μl的生理鹽水作為對照，和雄性尿液偏好實(shí)驗(yàn)相同，兩張濾紙片同時放入小鼠籠中，進(jìn)行5min的實(shí)驗(yàn)錄像。每只實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行1至2次的雄性尿液和雌性尿液偏好的實(shí)驗(yàn)。

嗅覺辨別行為

2個相同的木箱(45cm×45cm×30cm)，每個箱子內(nèi)放置2個間隔10cm的瓷皿。在每個瓷皿內(nèi)放置1張滴10μl的未稀釋的檸檬香精、薄荷香精或蒸餾水的濾紙。嗅覺辨別任務(wù)嗅覺辨別是指從一組氣味中辨別出不同和相同氣味，是嗅覺系統(tǒng)的基本功能之一。本實(shí)驗(yàn)使用薄荷香精和檸檬香精氣味，小鼠對這2種氣味沒有偏好。采用在嚙齒類動物中常用的習(xí)慣化－去習(xí)慣化模型，在此實(shí)驗(yàn)過程中，把小鼠頭朝某一個方向放入木箱內(nèi)，小鼠在箱內(nèi)自由活動。每個動物有6次任務(wù)，前5次任務(wù)使動物對某種氣味產(chǎn)生習(xí)慣化。前5次任務(wù)中，木箱內(nèi)的2個瓷皿內(nèi)，隨機(jī)滴入檸檬香精或蒸餾水，每次任務(wù)允許小鼠在木箱內(nèi)停留5min，兩次任務(wù)之間間隔15min。在第6次任務(wù)時，兩個瓷皿內(nèi)滴入新異氣味(薄荷香精)或蒸餾水。觀察小鼠嗅瓷皿內(nèi)氣味的時間，當(dāng)小鼠距離瓷皿1cm內(nèi)，并作出嗅的動作時開始計(jì)時。若動物在第6次任務(wù)時停留在新異氣味的時間多于第5次任務(wù)時停留在習(xí)慣氣味側(cè)的時間，說明動物能分辨出2種不同的氣味，反之，則不能分辨出不同氣味。不同動物及不同任務(wù)之間，及時清理木箱、瓷皿，并更換濾紙。

曠場行為測試

曠場（Openfield）實(shí)驗(yàn)箱分為大鼠實(shí)驗(yàn)箱和小鼠實(shí)驗(yàn)箱兩種。小鼠曠場實(shí)驗(yàn)箱的規(guī)格為底邊50cm的正方形，高度為45cm的灰白色箱體。大鼠實(shí)驗(yàn)箱的規(guī)格為底邊1m的正方形，高度為45cm的黑色箱體。在箱體正上方有一攝像頭，具體高度可隨情況而定但一定要使攝像頭的視野覆蓋整個實(shí)驗(yàn)箱體內(nèi)部。攝像頭通過數(shù)據(jù)線連接到電腦上，通過專業(yè)的行為學(xué)軟件自動記錄小鼠的行為。動物行為學(xué)軟件為VisuTrack。將每只小鼠的頭朝同一方向放入曠場行為箱中，記錄5min內(nèi)小鼠爬格子的次數(shù)以檢測小鼠的活動量，直立(后腳站立)的次數(shù)評價小鼠對新異環(huán)境的探究行為。

腦聲常談建立了多個《動物模型構(gòu)建與行為評估》交流群，群內(nèi)分享各種經(jīng)典和前沿的行為范式，共同交流解決動物實(shí)驗(yàn)中遇到的棘手問題，避坑少走彎路！有需要的老師可以掃碼添加微信進(jìn)入討論群！

攻擊行為范式

領(lǐng)地攻擊行為學(xué)實(shí)驗(yàn)采用的是經(jīng)典的“居民-入侵者”行為學(xué)范式。實(shí)驗(yàn)開始之后，將一只群養(yǎng)的BALB/c雄性入侵小鼠放入至本地小鼠的籠子當(dāng)中進(jìn)行15min的測試，過程錄像。兩只小鼠進(jìn)行活動的過程當(dāng)中，本地小鼠主動地利用鼻子去嗅聞入侵小鼠生殖器的時候，會被定義為“生殖器嗅聞（genital sniff）”；當(dāng)本地小鼠主動地用鼻子去接觸入侵小鼠生殖器以外的身體其他部位時，會被定義為“社交接觸（social contact）”；“攻擊行為（attack）”則是指本地小鼠對入侵小鼠進(jìn)行撕咬，摔跤，站立拳擊等行為，每只實(shí)驗(yàn)小鼠將進(jìn)行2到3次的攻擊行為學(xué)測試，每次測試之間時間間隔至少一天以上。

氣味探索實(shí)驗(yàn)

氣味探索實(shí)驗(yàn)儀器分為兩部分1實(shí)驗(yàn)箱體：氣味實(shí)驗(yàn)箱用無味的亞克力塑料板制作而成，箱體長為40cm，寬度和高度均為30cm，四周為黑色，下方無色透明。2給氣系統(tǒng)：主要由給氣泵、活性炭、流量計(jì)、三通管組成，這些設(shè)備之間用無味的塑料軟管連接。氣味使用給氣泵吹入，在箱體一角底部有直徑為1cm的圓孔用于實(shí)驗(yàn)氣味的進(jìn)入。使用流量計(jì)控制氣體的出入量穩(wěn)定在1L/min。在實(shí)驗(yàn)氣味和給氣泵之間放置活性炭用來去除其他氣味。在箱體上方有50cm處放置攝像頭用于記錄小鼠行為，使用Anymaze軟件進(jìn)行記錄。

氣味躲避實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前一天把小鼠放入實(shí)驗(yàn)箱體適應(yīng)10min。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)箱體并打開行為學(xué)軟件設(shè)置好程序，打開給氣泵。首先把小鼠放入箱體讓其適應(yīng)3min，此時給予空氣。適應(yīng)結(jié)束后給予礦物油氣味10min，最后給予0.1%2MT氣味10min。此實(shí)驗(yàn)過程全程用Anymaze軟件進(jìn)行記錄。通過軟件統(tǒng)計(jì)小鼠探索氣味區(qū)域的時間以及和恐懼相關(guān)的指標(biāo)。每只小鼠測試完畢用75%酒精徹底擦凈箱體避免小鼠留下氣味對后面實(shí)驗(yàn)的造成影響。

嗅覺剝奪1周后進(jìn)行小鼠行為學(xué)觸須視頻拍攝，觀察和統(tǒng)計(jì)分析小鼠嗅覺剝奪側(cè)和對側(cè)觸須的擺動頻率及觸須屈曲的時間。整個行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在安靜的環(huán)境中進(jìn)行，室溫18~25℃，無噪聲和強(qiáng)光刺激。

埋藏食物實(shí)驗(yàn)（Buried Food Test）

實(shí)驗(yàn)第一天喂食小熊餅干，讓小鼠熟悉并知曉餅干為可吃食品；第二天，禁食24h（不禁水）；第三天，準(zhǔn)備兩個新籠子，一個為小鼠適應(yīng)籠（40cm×20cm），另一個為測試籠（60cm×30cm），均鋪上3cm左右的新墊料，在測試籠的其中一角墊料下方埋藏一塊小熊餅干。將小鼠放在適應(yīng)籠適應(yīng)5min，之后放入測試籠，讓其在中探索10min，并記錄下其找到餅干的時間，找到餅干的時間>5min視為嗅覺損毀。當(dāng)每只小鼠測試完畢后，需更換或攪拌適應(yīng)籠和測試籠的墊料，以防餅干遺留氣味不勻的情況。

水迷宮測試（MirrorWaterMaze，MWM）

該實(shí)驗(yàn)均在一個1.5m直徑的水池中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)總長為7天，水池中水溫度保持在23℃左右。實(shí)驗(yàn)開始前期，由水迷宮測試軟件（SMART3.0）將水池均分為四個象限（A，B，C，D;A象限對C象限，B象限對D象限），并在每個象限的池邊貼上不同拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記物，以形成不同象限記憶點(diǎn)。第一天，在其中一個象限內(nèi)放上水平臺并注水，但此時，水池內(nèi)平臺恰好高于水面，以讓小鼠知曉在水池內(nèi)有平臺的存在。小鼠從四個象限中任意一個象限進(jìn)入水池，并在水池內(nèi)自由探索1min，當(dāng)1min探索時間結(jié)束后，若小鼠還沒有找到水平臺，將人為引導(dǎo)小鼠到水平臺之上，并讓其在水平臺上呆15s，熟悉平臺。對照組小鼠和實(shí)驗(yàn)組小鼠均分為四組，設(shè)立不同的水平臺位置，并由不同位置入水，以排除其他影響因素。第二天，將水池中的水沒過水平臺3cm左右，保證小鼠可以在水平臺上站穩(wěn)但有看不見平臺，重復(fù)第一天的實(shí)驗(yàn)操作。第三天到第六天，重復(fù)第二天的實(shí)驗(yàn)操作，并且每次在實(shí)驗(yàn)前，保證水池中水的清潔度。第七天檢測小鼠的空間記憶結(jié)果，將水池中的平臺撤出水池，小鼠將由所設(shè)平臺的對面平臺入水，記錄小鼠找到平臺的時間（Time of Latency to platform），在平臺區(qū)域停留時間（Time of platform），在平臺所在象限探索時間（Time of Quadrant）。在實(shí)驗(yàn)開始前，需要將進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的小鼠提前2h搬去水迷宮行為檢測的房間，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，排除其他環(huán)境干擾。

條件恐懼箱實(shí)驗(yàn)（Fear Conditioning Test，F(xiàn)CT）

此實(shí)驗(yàn)為期4天，實(shí)驗(yàn)期間保持每天實(shí)驗(yàn)時間的一致性，并在每次實(shí)驗(yàn)前2h將小鼠放置到條件恐懼箱測試房間。條件恐懼箱主要包括視頻采集系統(tǒng)，聲音刺激系統(tǒng)，足部刺激板系統(tǒng)，以及場景設(shè)置。條件恐懼箱實(shí)驗(yàn)第一天為適應(yīng)期（Habituation），讓小鼠在條件恐懼測試箱中停留600s，使其熟悉箱中的環(huán)境（在箱中貼有條紋背景）；第二天，為訓(xùn)練期（Training），將小鼠放入箱中后，給予環(huán)境、聲音和足部電刺激的配對刺激（聲音:19s，98db，2kHz;足擊:1s，0.75mA;），總時長為820s，共計(jì)5個刺激循環(huán)，刺激間隔為2min。第三天為場景條件恐懼記憶測試（Context），小鼠在條件恐懼箱中自由探索600s，環(huán)境與第二天訓(xùn)練期給予的環(huán)境保持一致，不給予聲音刺激和足底電刺激。第四天為線索條件恐懼記憶測試（Cue），小鼠在箱中探索820s，更換箱中的環(huán)境背景，給予與訓(xùn)練期配對的五個循環(huán)的聲音刺激（20s，19db，2kHz），每次聲音刺激間隔2min，無足底電刺激。在實(shí)驗(yàn)過程中需每次清潔箱中環(huán)境，并用酒精擦拭，盡量去除上一只測試鼠所遺留的痕跡。在本實(shí)驗(yàn)中，均在MED軟件以及裝置下完成。

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