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本科生研學欄目

D-試驗

紅霉素誘導克林霉素耐藥試驗

什么是D-試驗？

紅霉素誘導克林霉素耐藥D-試驗，是一種簡便的確定誘導型克林霉素耐藥性的紙片試驗方法。將含有15mg紅霉素的紙片放在離含有2mg克林霉素的紙片15~26mm（紙片邊緣到邊緣的距離）的地方。經孵育后，觀察細菌是否誘導產生克林霉素耐藥性。

D-試驗適用于：葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌屬、β-溶血性鏈球菌

①鄰近紅霉素紙片側克林霉素出現似字母D的抑菌環提示存在可誘導的克林霉素耐藥，此為D-試驗陽性；

②如果克林霉素抑菌環不出現D形現象，提示克林霉素處于敏感狀態，D-試驗為陰性。

如下圖所示：

D-試驗

D-試驗

如何報告D-試驗結果?

臨床微生物學實驗室對試驗結果的報告和質控：如果葡萄球菌對紅霉素表現為耐藥，但對克林霉素敏感，這種情況下就要進行D-試驗，如果不進行D-試驗即報告克林霉素敏感或根據紅霉素耐藥即簡單推斷克林霉素耐藥是不正確的。

如何根據D-試驗向臨床報告結果，見表1：

○ 為什么要做D-試驗 ○

背景

近幾年來，隨著抗菌藥物在臨床上的廣泛和大量應用，葡萄球菌已經成為引起醫院內感染和社區化膿性感染的重要病原菌，大環內酯類(macrolide)和林可酰胺類(lincosamide)被廣泛應用于臨床葡萄球菌感染的經驗治療，尤其是林可酰胺類藥物克林霉素，它具有組織滲透性強的特性故常作為青霉素過敏或耐甲氧西林葡萄球菌的首選替代藥物。

原因

但是對大環內酯類和林可酰胺類抗生素的獲得耐藥性在葡萄球菌中越來越普遍，尤其是克林霉素誘導耐藥現象已引起廣泛關注，針對克林霉素誘導耐藥現象NCCLs在2004年的藥敏測定指南M100-S14手冊中提出: “由于大環內脂類耐藥的葡萄球菌可改變、誘導克林霉素耐藥”，因此提倡每個實驗室都應根據“D-試驗”來報告克林霉素耐藥性的結果。

背景與原因

○ D-試驗的原理機制 ○

大環內酯類、林可酰胺類和鏈陽霉素類是3類功能密切相關但結構不同的抗生素，這些抗生素常共同地被稱為MLS群，MLS群抗生素通過結合細菌核糖體50S亞基，阻斷轉肽作用及mRNA位移，選擇性抑制蛋白質合成，以達到抑菌效果。

葡萄球菌對大環內酯類抗生素的耐藥機制主要有兩種，即主動泵出和核糖體靶位改變。

1、主動泵出耐藥機制

主動泵出耐藥機制：由msrA基因編碼，表現為對大環內酯類及鏈陽霉素B類抗菌藥物耐藥，而對克林霉素敏感，稱為MS表型耐藥：即紅霉素耐藥，克林霉素敏感。

2、核糖體靶位改變

核糖體靶位改變：受erm基因調控，由erm基因編碼產生的紅霉素核糖體甲基化酶導致23S rRNA的甲基化作用，降低了大環內酯類、林可酰胺類等MLS群抗菌藥物對細菌核糖體的結合從而產生耐藥。由erm基因介導的耐藥又可分為誘導型和結構型。

①MLSB 結構型耐藥：即紅霉素耐藥，克林霉素耐藥。erm基因穩定表達。

②MLSB 誘導型耐藥：即紅霉素耐藥，克林霉素敏感（誘導耐藥）。某些菌株有erm基因但沒有穩定表達，erm基因需要誘導劑誘導才能表達對克林霉素耐藥，否則體外試驗可能會表現為對克林霉素敏感，紅霉素可作為這種誘導劑（誘導濃度一般在10-100ng/ml,這個濃度并不高，并不具有治療濃度）。這些分離菌在體外表現對紅霉素耐藥而對克林霉素敏感。

原理與機制

○ 意義 ○

“erm”基因與翻譯過程極易發生突變，常可突變出不需要“誘導”物質存在即可表達生成甲基化酶蛋白的菌株。所以，如果感染致病性球菌具有“erm”基因時，我們用克林霉素進行治療時，雖然可以抑制未突變株，但突變株可迅速增值，導致治療失敗。

所以，當我們遇到紅霉素耐藥，而克林霉素敏感或中介的情況時，一定要加做一個“D-試驗”，去觀察該細菌是否存在“erm”基因。

①當“D-試驗”陽性時，證明該菌存在“erm”基因，我們參照CLSI M100（2022）報告該菌對克林霉素耐藥，并備注實驗推導克林霉素耐藥。

②當“D-試驗”陰性時，表示該菌不存在“erm”基因，這時的克林霉素處于敏感狀態，可用于對該菌引起的感染的治療。而紅霉素的耐藥是由非“erm”基因表達所致，如常見的“msrA”基因表達（MS表型耐藥）。

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CLSI M100（2022）部分內容

意義

○ 總結 ○

總的來說，當我們遇到紅霉素耐藥的葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌屬、β-溶血性鏈球菌，我們需要進行D-試驗，來驗證克林霉素對該菌是否敏感，若D-試驗結果為陰性+紅霉素耐藥（R）+克林霉素敏感（S），則克林霉素可用于該菌的治療。