盡管最近在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測定和預(yù)測方面取得了突破，但碳水化合物的結(jié)構(gòu)研究仍然是一個挑戰(zhàn)。

2024年12月31日，清華大學/深圳醫(yī)學科學院顏寧團隊在PNAS在線發(fā)表題為“CryoSeek II: Cryo-EM analysis of glycofibrils from freshwater reveals well-structured glycans coating linear tetrapeptide repeats”的研究論文，該研究報告了在清華荷塘淡水中發(fā)現(xiàn)的一種糖纖維的冷凍電鏡分析。研究人員將其命名為TLP-4，它是由一條四肽重復(fù)序列的線性鏈構(gòu)成的，上面包裹著一層厚達40nm的聚糖。

在每次重復(fù)中，兩個聚糖與3,4-二羥基脯氨酸O鍵相連，另一個聚糖與相鄰的絲氨酸或蘇氨酸相連。原纖維的結(jié)構(gòu)完全通過聚糖填充來維持。生物信息學分析證實了TLP-4重復(fù)序列在物種間的保守性，表明存在大量有待發(fā)現(xiàn)的糖原纖維。該研究不僅為聚糖在生物組裝中的結(jié)構(gòu)作用提供了有價值的見解，而且還展示了我們最近制定的CryoSeek研究策略在尋找生物實體和建立碳水化合物結(jié)構(gòu)研究原型方面的潛力。

另外，2024年10月9日，清華大學顏寧及李張強共同通訊在PNAS在線發(fā)表題為“CryoSeek: A strategy for bioentity discovery using cryoelectron microscopy”的研究論文，該研究采用冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）對清華荷塘的過濾水樣進行了分析，報告了兩個高度相似的螺旋原纖維的結(jié)構(gòu)測定和表征，命名為TLP-1a和TLP-1b，每個直徑約8 nm，寬15-?。這些原纖維由類似的蛋白質(zhì)原聚體組裝而成，其結(jié)構(gòu)在CryNet中方便地自動建模。原體結(jié)構(gòu)與任何現(xiàn)有的實驗結(jié)構(gòu)都不匹配，但與許多未知功能的預(yù)測結(jié)構(gòu)具有相同的折疊。原聚體n+4的氨基末端β鏈插入到原聚體n的裂縫中，完成免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域。這種包裝機制，被稱為供體-鏈交換（DSE），已經(jīng)在幾種細菌菌毛組裝中觀察到，其中供體是原聚體n+1。盡管形狀和厚度不同，但這種相似性表明TLP-1a/b原纖維可能代表未表征的細菌毛。該研究體現(xiàn)了結(jié)構(gòu)生物學中新興的范式，其中高分辨率結(jié)構(gòu)先于并指導(dǎo)先前未知物體的識別和功能表征（點擊閱讀）。

碳水化合物是四種基本有機生物分子之一。它們是重要的能量來源和結(jié)構(gòu)成分，在蛋白質(zhì)折疊、細胞識別和免疫反應(yīng)等許多生物過程中起著至關(guān)重要的作用。低聚糖或多糖形式的碳水化合物，為了簡單起見，研究人員將其統(tǒng)稱為聚糖，可以與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)共價結(jié)合，形成稱為糖綴合物的結(jié)構(gòu)。單糖的種類和化學結(jié)構(gòu)、分支模式和鏈長度的顯著復(fù)雜性導(dǎo)致了糖綴合物的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，同時也給結(jié)構(gòu)測定帶來了巨大的挑戰(zhàn)。由于缺乏關(guān)于聚糖的結(jié)構(gòu)信息，從而阻礙了對聚糖的功能和作用機制的全面認識。

單分子成像技術(shù)的最新進展使直接闡明聚糖的鍵和結(jié)構(gòu)成為可能。然而，這些方法通常不能捕獲原生狀態(tài)下的糖綴合物。雖然冷凍電鏡（cryo-EM）等結(jié)構(gòu)方法有時可以幫助解析聚糖結(jié)構(gòu)，但它們通常只能為修飾位點附近的聚糖或由凝集素或特異性抗體等糖結(jié)合蛋白穩(wěn)定的聚糖提供適度的分辨率細節(jié)。盡管基于人工智能的結(jié)構(gòu)預(yù)測已經(jīng)徹底改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)生物學，但缺乏聚糖結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)阻礙了對聚糖結(jié)構(gòu)的準確預(yù)測。

在最近的一項研究中，研究人員在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的原生masgonsemi的完整結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了許多阿拉伯聚糖。這些結(jié)構(gòu)良好的聚糖與羥脯氨酸（Hyp）殘基相連，并在mastigoneme組裝中發(fā)揮重要作用。本研究強調(diào)了采用合適的方法和選擇合適的研究目標對準確測定聚糖結(jié)構(gòu)的重要性。根據(jù)這一思路，研究人員將冷凍電鏡作為一種發(fā)現(xiàn)工具，并提出了一種名為CryoSeek的研究策略。

根據(jù)CryoSeek的工作流程，從淡水中發(fā)現(xiàn)厚聚糖包被的線性多肽（圖源自PNAS）

利用CryoSeek對從清華荷塘采集的水樣進行分析，在原始電子顯微照片中觀察到大量不同長度和寬度的原纖維。盡管顆粒不均勻且數(shù)量有限，但研究人員成功地確定了兩種相關(guān)原纖維的結(jié)構(gòu)，命名為TLP-1a和TLP-1b。通過CryoNet自動建模和生物信息學分析，研究人員對TLP-1a/b的組裝機制和可能的起源有了深入的了解。CryoSeek舉例說明了結(jié)構(gòu)引導(dǎo)發(fā)現(xiàn)未表征生物實體的新興范例，這也可能有助于識別適合聚糖結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)。在TLP-1a/b成功的基礎(chǔ)上，研究人員繼續(xù)努力確定其他原纖維的結(jié)構(gòu)。

該研究報告了3.3 ?分辨率的糖原纖維的冷凍電鏡分析。出乎意料的是，冷凍電鏡重建顯示，這個8納米寬的纖維中唯一的蛋白質(zhì)片段是中心的一個由四肽組成的線性肽鏈。因此，研究人員將其命名為TLP-4。四肽重復(fù)序列的線性鏈上覆蓋著一層厚厚的、組裝良好的糖殼。在每個重復(fù)中，鑒定出三個聚糖，兩個與保守的二羥基脯氨酸（diHyp）相連，一個與絲氨酸或蘇氨酸相連。緊密排列的聚糖決定了原纖維的整體結(jié)構(gòu)。總之，研究證明了CryoSeek在確定合適的模型系統(tǒng)以表征聚糖結(jié)構(gòu)方面的巨大潛力。

參考消息：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2423943122