探索高原大棚越冬結球甘藍游離小孢子培養新方法

基金項目：國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-23-G07）；河北省現代農業產業技術體系建設專項（HBCT2024140201，HBCT2024140203）

康少輝等

結球甘藍為一年生至二年生的十字花科蕓薹屬植物，具有顯著的雜交優勢。傳統育種方式主要是自交不親和系制種和雄性不育系制種 ，利用甘藍雜交優勢培育雜種 1 代。自交不親和系制種的優勢在于操作簡便，雜種 1 代種子產量較高，可以同時進行正反交。但因花期自交時出現嚴重結實不良現象，需人工蕾期自交授粉，導致人工成本高，雜種 1代種子純度低，而且需要多年連續自交，育種年限長；雄性不育系制種是一種重要的制種方法，其優勢在于可以免去人工去雄 ，從而減少生產成本，第一代雜交種子具有更高的純度，但其不足之處在于保持系的選育和雄性不育系的培育比較困難。

游離小孢子育種通過游離小孢子在離體條件下進行培養，通過胚狀體或愈傷組織的誘導，再生出完整的單倍體植株，完全的單倍體細胞得以再生，而后經過誘導使染色體加倍 ，成為正常可育DH 系。該技術可得到純合的二倍體，消除了顯隱性基因的影響，獲得遺傳性狀穩定的種質，縮短育種年限 4~5 a （年）（圖 1）。該技術是一種快速獲取純系、用于作物遺傳改良的一種重要方法。

圖 1 傳統育種與游離小孢子培養技術路線

1982 年，Lichter 利用游離小孢子培養法，首次成功地得到了油菜游離小孢子植株，在此基礎上，以芥菜、大白菜、白菜、甘藍和蕪菁等為材料，對其進行了游離小孢子培養，并獲得了再生植株。現已在雜優親本培育、常規育種、遺傳群體構建和轉基因等研究中廣泛應用。甘藍游離小孢子培養普遍存在出胚難、出胚率低等現象，探索提高甘藍出胚率的途徑也就成為本次研究的重點。由于高原地區冬季溫度低，甘藍露地越冬育種會出現凍死、凍傷的現象，成活率低，采用大棚栽培方式可以隨時控溫，使甘藍能夠很好地進行春化、抽薹、結籽。筆者團隊從 2017 年研究探索，初步建立了高原大棚越冬結球甘藍游離小孢子培養技術體系，利用該技術先后選育的張甘 40、張甘 60 和張甘 65 等系列品種，居國際先進水平，在全國廣泛推廣應用，現將該技術總結如下。

1 材 料

1.1 播種

8 月中旬在溫室大棚穴盤育苗，選擇 72 穴育苗盤，通常情況下，育苗基質一般選用草炭、蛭石、珍珠巖的配比（體積比）為 8∶1∶1，每穴 1 粒，再用蛭石覆土 ，澆透水，苗期常規管理。

1.2 整地規劃

大棚內起壟栽培，鋪設滴灌帶，壟溝 70 cm，壟高 20 cm，壟面 30 cm。

1.3 定植

9 月中旬，小苗長到 5~6 片真葉時開始定植，每壟定植 1 行，株距 50~60 cm，標明號碼牌，定植后澆定植水，后期田間常規管理，田間見干見濕，預防病蟲害。

1.4 春化

1 月初大棚內開始降溫，白天將棉簾拉開一半，使溫度保持在 0~10 ℃，晚上關閉棉簾。低溫春化時間為 30~40 d，2 月中旬白天將棉簾全部拉開，開始升溫，使溫度維持在 20~25 ℃。

1.5 劃十字

春化結束后，在球頂部用小刀劃十字，深度以不傷害生長點、長度以外皮宜崩開為宜。

2 實驗室準備

2.1 超凈工作臺滅菌

超凈工作臺用 75%乙醇擦拭后，在紫外燈下滅菌 30 min，再進行 30 min 通風。

2.2 滅菌

B5 洗液：分裝到三角瓶中，每瓶 30~40 mL，用雙層透氣封口膜密封好，標明號碼，120 ℃高壓滅菌 25 min，滅菌完成后，保存，避免粉塵污染。

NLN 培養液：首先用 0.45 μm 微孔濾膜抽濾 1次、0.22 μm 微孔濾膜抽濾 2 次，在超凈工作臺上用0.22 μm 微孔濾膜抽濾 1 次，分裝到三角瓶中，每瓶30~40 mL，用雙層透氣封口膜密封好，標明號碼，保存，避免粉塵污染。

超純水：分裝到帶蓋的 500 mL 玻璃瓶中，每瓶150~200 mL，蓋子不要蓋太緊，120 ℃高壓滅菌25 min，滅菌完成后將蓋子蓋緊，標明號碼，保存，避免粉塵污染。

3 選 蕾

因品種而異，一般 3 月初進入初花期，選擇在09：00—10：00 采蕾，晴天或陰雨天皆可（郭世星等 、孫繼峰 研究報道低溫有利于游離小孢子的胚胎發生）。選取主枝或生長狀態較好的 1 級側枝花蕾（圖 2），大小在 4.50~5.49 mm 之間 ，裝入培養皿中，標明號碼，放置在盛有冰袋的保溫箱中。因不同的甘藍品種花蕾的發育時期不同，可利用顯微鏡（25×）、坐標紙選取單核靠邊期的花蕾（圖 3）。選蕾完成后（20 蕾左右）標明號碼，倒入 60 目鐵絲網中，封口，放置于濕潤的條件下低溫保存（4 ℃冰箱）1~2 h，有利于出胚。

圖 2 主枝或生長狀態較好的 1 級側枝花蕾

圖 3 單核靠邊期的花蕾

4 花蕾消毒

將所選擇的花蕾置于一個三角形的玻璃瓶中，以 75%乙醇進行 1 min 的滅菌，再用 0.1%的升汞進行 8~10 min 的滅菌，最后用超純水搖晃清洗 3 次，每次 1 min。

5 抽提小孢子

將花蕾放置于玻璃管中，加入 5~7 mL B5 洗液，用玻璃棒研磨使小孢子散出，通過雙尼龍網過濾器將小孢子濾液注入 10 mL 離心管內。用移液槍吸 B5 洗液沖洗過濾器中的小孢子，沖 2~3 次后，使 10 mL 離心管中小孢子懸浮液稀釋，蓋蓋，用Parafilm 膜封口，標明名稱。

6 離 心

將小孢子懸浮液 用離心機 2000 r·min -1 離心5 min ，將離心管中的上層清液倒出，再加 10 mL B5洗液，蓋蓋，用 Parafilm 膜封口。搖晃離心管將沉淀的小孢子沖散，再次將懸浮 用離心機 2000 r·min -1離心 5 min ，倒出上層清液，再加 10 mL B5 洗液，蓋蓋 ，用 Parafilm 膜封口。搖晃離心管將小孢子 沉 淀 物（圖 4）沖散，再次將懸浮液 用離心機2000 r·min -1 離心 5 min， 倒出上層清液。

圖 4 小孢子沉淀物

7 出胚培養

7.1 熱激培養

將沉淀的小孢子用 NLN-17 [12-13] 培養液稀釋至淡黃色，用移液槍吸取 3 mL 分裝到 60 mm 的培養皿中，在培養皿中再注入 5 mL NLN-17 培養液，用Parafilm 膜封口，標明名稱和時間。把分裝好的培養皿放置在 32 ℃恒溫培養箱中暗培養 2~3 d（48~72 h 之間）。

7.2 置換培養

熱激后檢查培養皿中是否有出現污染情況，如果沒有污染，就利用倒置顯微鏡（10×）挑選出大部分膨大的游離小孢子（圖 5）培養皿做置換。用移液槍把懸浮培養液吸入離心管中離心， 用離心機2000 r·min -1 離心 5 min ，倒掉 NLN-17 懸浮液體，留下沉淀的小孢子。用 NLN-14 培養液稀釋沉淀的小孢子，并將其分裝入 90 mm 培養皿中，一般每皿加入懸浮液 5 mL 左右，再注入 5 mL NLN-14 培養液，用 Parafilm 膜封口，標明名稱、時間 。

圖 5 膨大的游離小孢子

7.3 靜止培養

將封口的培養皿放置在 25 ℃的恒溫培養箱中進行暗培養，大約 15 d 后，觀察有無明顯的白色顆粒狀胚的形成，如果沒有則繼續培養，如果有可見的小白點狀胚出現，則改為振蕩培養。

7.4 振蕩培養

將出現有一定數量小白點狀胚狀體（圖 6）的培養皿放入 60 r·min -1 25 ℃恒溫搖床 上繼續進行暗培養。

圖 6 小白點狀胚狀體

8 胚狀體成苗培養

8.1 誘導培養

當暗培養的胚發育至子葉形胚時移入 B5固 體 培 養 基（B5 + Suc30 g·L -1 +Agar 10 g·L -1 +GA 3 0.1 mg · L - 1 ）上，在25 ℃ 12 h 光/12 h 暗2000 lx 光強條件下培養，進行再生苗的誘導直至出現不定芽（圖 7）。

圖 7 分離出的不定芽

8.2 繼代培養

不定芽長有 2~3 片小葉時，切下不定芽，轉接到固體培養基（MS+ Suc 30 g· L -1 +Agar 10 g· L -1 +6-Ba0.15mg·L -1 ）中，在25 ℃ 12 h 光/12 h 暗 2000 lx光強條件下培養（圖 8）。

圖 8 植株不定芽培養

8.3 生根培養

當 長 到 3~4 片 真 葉 時 ，轉 接 到 固體培養基（ MS+ Suc 30 g · L - 1 +Agar10 g · L - 1 +NAA0.1 mg · L -1 ）中，在 25 ℃ 12 h 光/12 h 暗 2000 lx 光強條件下進行生根培養（圖 9）。

圖 9 植株生根培養

9 植株移栽

當獲得的植株長有 5~6 片真葉時，打開封口膜煉苗（圖 10）2~3 d 后，從試管中取出，洗凈根系（一定要清洗干凈，否則后期會有污染），移栽到花盆中，3~4 d 后連盆帶苗端到溫室中（圖 11），3~4 d 后定植到溫室里，后期常規管理，培養成株。

圖 10 植株煉苗

圖 11 田間定植苗

10 倍性鑒定

由于小孢子培養出的植株是單倍體，育性差，不能正常結籽，在育種中往往不能被直接利用，必須誘導進行加倍（將含有 0.2%秋水仙堿水溶液的棉球置于單倍體植物的頂端分生組織和次生組織部位，誘導分生組織細胞染色體加倍）處理，使之成為雙單倍體（DH）植株。但通過誘導加倍的群體通常是單倍體、二倍體和多倍體組成的混合群體。通過倍性鑒定可快速獲得可用于遺傳和育種研究的大量二倍體植株。

利用流式細胞儀 可迅速準確地鑒定甘藍成株材料是否為二倍體，這種檢測不受植物取材部位和時間限制。

10.1 溶液配制

溶液Ⅰ：將 4.2 g 濃度為 0.1 mol·L -1 的檸檬酸和1 mL 的 0.5%的吐溫 20 混合，將其定容至 200 mL，在 4 ℃下保存備用。

溶液Ⅱ：將 28.65 g 濃度為 0.4 mol·L -1 的磷酸氫二鈉、碘化丙啶 20 mg 定容至 200 mL，在室溫下保存備用。

10.2 材料處理與檢測

選取組培苗嫩葉 1 cm 2 ，放入裂解液中（200 μL溶液Ⅰ和 600 μL 溶液Ⅱ），用鋒利的雙面刀片切碎葉片，靜置 5 min 使其裂解，經過尼龍篩網過濾，將所得濾液在離心機上 1000 r·min -1 離心 6 min，倒掉上清液。加入碘化丙啶染色劑，混勻，4 ℃避光靜置15 min 后，取液體加入流式細胞儀內進行檢測。以普通甘藍二倍體植株作對照，分離峰出現在熒光強度 200 處即為二倍體。