雖然免疫檢查點抑制劑（ICI）被認為是腫瘤的突破治療的突破口，但是只有少部分患者能從中獲益。腫瘤干性可能是免疫檢查點抑制劑耐藥性的潛在罪魁禍首，但缺乏直接的臨床數據。2022年4月，Genome Medicine雜志發表題目為Integrated analysis of single-cell and bulk RNA sequencing data reveals a pan-cancer stemness signature predicting immunotherapy response的研究論文，通過單細胞和常規轉錄組數據挖掘揭示腫瘤干性與免疫治療耐藥性之間的強大聯系，并開發出一種有前景的生物標志物，為克服免疫檢查點抑制劑耐藥性提供啟示。

1.腫瘤干性與免疫檢查點抑制劑耐藥相關

對兩個單細胞數據集黑色素瘤 (GSE115978)和基底細胞癌 (GSE123813)進行數據分析，并用CytoTRACE對細胞群的進行干性評分。然后利用應答 (R)和非應答 (NR)數據對細胞群進行注釋 (FigA、C)，通過聚類圖和箱線圖 (FigB、D)的對比，驗證了前人的研究結論：NR組表現出更高的腫瘤干性。

2.單細胞泛癌篩選干性signature

通過把干性分數正相關的基因 (Gx)與惡性細胞中上調的基因 (Gy)取交集，并計算34個scRNA-Seq數據集 (G1-G34)各基因Spearman R的均數 (Fig2A)，把Spearman R大于0.4的基因篩選出來，組成腫瘤細胞干性signature。

對干性signature進行富集分析，主要富集在缺氧、糖酵解、泛素化、EPH-腎上腺素信號通路、WNT信號通路和核苷酸切除修復 (NER)等過程上 (Fig2B)。其中一些基因已被報道與免疫治療不良結果有關，如EPHA3, EPHA7, ENO1, ACTG1, DKK2, NPM1和BCL10。

3.利用TCGA泛癌數據分析干性signature與免疫抑制之間的關系

在TCGA的30種不同種類型中，對干性signature和75種免疫相關基因進行徹底的分析，干性signature和免疫相關基因的表達水平之前普遍存在負相關 (Fig3A)。然后評估免疫細胞的滲透狀態，以更好地表征腫瘤免疫微環境 (TIME)。高表達干性signature的腫瘤細胞免疫細胞減少，包括CD8+ T 細胞、NK細胞和巨噬細胞 (Fig3B)。上述結果表明，干性signature與抗腫瘤免疫呈現負相關。

把干性signature和10個與較差的免疫應答Hallmark相關通路進行相關分析 (Fig3A)，結果顯示干性signature與大部分通路呈正相關。然后用干性signature與ITH和TMB進行相關分析 (Fig3D、Fig3E)，結果顯示干性signature與ITH和TMB呈正相關。

TMB越高，免疫治療效果越好，與Fig3E圖中干性signature與 TMB呈正相關結果沖突。為了更好地闡述 TMB與腫瘤干性的關系，作者根據干性signature和 TMB得分的中位值進行分組，共分為高腫瘤標志物/高TMB (HSHT)、高腫瘤標志物/低TMB(HSLT)、低腫瘤標志物/高TMB (LSHT)和低腫瘤標志物/低TMB (LSLT)等四個亞組。補充文件中A和B圖，結果顯示，高腫瘤干性 (HS)可以促進免疫抵抗和逃避，跟低TMB水平 (LT)則與抗原性缺乏導致的抗腫瘤免疫降低有關預期的那樣，HS組和LT組的細胞毒性淋巴細胞的浸潤都減少了。補充文件中C圖，結果表明，LSLT的細胞毒性淋巴細胞水平高于HSHT。綜上所述，無論TMB水平如何，低干性signature的腫瘤比高干性signature的腫瘤表現出更好的腫瘤免疫。

4.用干性signature去預測免疫治療結果

用7種機器學習算法對模型進行訓練，并對每個模型進行重復10次的5折交叉驗證進行參數優化。分析發現，貝葉斯模型 (nb)模型驗證結果最好 (Fig4A、4B)。然后用預測效果最好的nb模型在驗證集和測試集中進行驗證 (Fig4C、4D)。

對干性signature進一步分析，與先前signature在泛癌和黑色素瘤中進行比較，發現干性signature的AUC值保持在前三 (Fig5A、5B、5C)。

5.利用CRISPR篩選數據探索干性signature潛在治療靶點

系統地收集了7個CRISPR隊列中基因敲除基因的免疫應答數據，根據這些CRISPR隊列中使用的模型細胞和治療條件，進一步將其劃分為17個數據集 (Fig6A)。這些CRISPR數據庫共記錄了22,505個基因。作者根據基因的平均z分數對基因進行排序，排名靠前的基因屬于免疫抗性基因，基因敲除后促進抗腫瘤免疫。排名靠后的是免疫敏感基因，在基因敲除后會抑制抗腫瘤免疫。通過比較干性signature和其他預測的signature在top1%，2%，3%中的比例 (Fig6B)，發現干性signature占比更高，干性signature更有可能是免疫耐受基因。20個干性signature基因進入了top3%，20個干性signature通過多個獨立的CRISPR數據集 (Fig6C)得到驗證，這些干性signature可能成為與ICB協同治療的潛在靶點。

作者巧妙地利用單細胞和轉錄組的公共數據，通過對免疫治療和腫瘤干性進行綜合分析。文章有許多值得借鑒的地方，比如，作者將單細胞數據和轉錄組數據結合起來用，而不是只用單細胞數據或轉錄組數據。因為單細胞敏感，但是有時可靠性差，這是單細胞技術上的局限；轉錄組測序成熟，但是敏感性和精確性不如單細胞測序。希望各位果友能從這篇文章中得到啟發，早日發表自己的文章。

單細胞公共數據挖掘，除了聯合常規轉錄組分析外，還可以借助表型聯合分析的方式，如鐵死亡+EMT等。當然，現在發表純生信是不可能了，需要實驗驗證了。