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點突變作為基因研究領域的重要突變類型，在疾病機制解析和治療方案開發中發揮著不可替代的關鍵作用。

點突變（point mutation）是突變的一種類型，在遺傳材料DNA或RNA中，會使一個堿基核苷酸替換成另一種核苷酸。通常這個術語也包括只作用于單一堿基對的插入或刪除。

廣義上，點突變可以是堿基替換，單堿基插入或堿基缺失；狹義上，點突變也稱作單堿基替換（basesubstitution）。堿基替換又分為轉換（transitions）和顛換（transversions）兩類。

點突變在多個領域發揮作用，在基礎科學研究中，通過引入特定點突變，研究基因或蛋白質的功能域；在研究疾病機制和模型構建上，可以重現驅動突變，探索腫瘤發生或耐藥性；在藥物開發和篩選領域，可以做藥物敏感性測試，篩選針對特定突變的候選藥物。

常見的點突變構建方法有以下三種：

1.堿基編輯器

堿基編輯系統主要基于融合的脫氨酶類型分為兩大類：胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE）。

CBE系統通過融合胞嘧啶脫氨酶，可在不引起DNA雙鏈斷裂（DSB）的情況下，將靶位點范圍內的胞嘧啶（C）脫氨基轉化為尿嘧啶（U），最終經DNA修復或復制實現C→T（或C→G）的堿基轉換。

而ABE系統當融合蛋白在sgRNA的引導下靶向基因組DNA時，腺嘌呤脫氨酶可結合到ssDNA上，將一定范圍內的腺嘌呤(A)脫氨變成肌苷(I)，I在DNA水平會被當做G進行讀碼與復制，最終實現A-T堿基對至G-C堿基對的直接替換。

堿基編輯器的優缺點：堿基編輯器不需要依賴DNA雙鏈斷裂（DSB）,所以突變效率較高。由于脫氨酶無特異性，可能導致PAM（4-7位）附近堿基無差別突變。堿基替換種類較少，無法任意轉換堿基。

2.HDR同源重組

①RNP法是將gRNA和Cas9蛋白在體外形成RNP復合物，再與單鏈Oligo共轉染進細胞，由RNP復合物對基因組靶點進行識別與切割，再以單鏈Oligo為模板進行同源重組修復，實現基因點突變。這種方法適用性廣，編輯效率高，流程簡單，項目周期短。

②質粒抗性法是使用gRNA和Cas9共表達的質粒，與Donor質粒一起共轉染細胞。Donor質粒兩條同源臂中間構建了一個兩端帶有loxp重組位點的抗性基因表達盒，目標點突變則通過同源臂引入。這種方法受突變點位置的限制較小，通過抗性篩選，可以提高陽性率。

③AAV-Donor法是以AAV作為載體帶入Donor模板進行同源修復。AAV基因組是游離的DNA單鏈，而且在細胞內可以保留較長時間，可以大幅提升同源重組效率。這種方法適用于懸浮細胞等難轉染的細胞系。

3.先導編輯點突變

Prime Editing能夠實現在不依賴DNA雙鏈斷裂（DSB）和外源供體DNA模板 的情況下，實現靶向性的點突變、小片段插入或缺失。

Prime Editing的基本原理：首先，pegRNA中的spacer結合編輯鏈，使pegRNA+ncas9-RT定位于基因組上；隨后，nCas9發揮其單鏈切割功能，在非靶向鏈上產生切口；接著，PBS與DNA模板結合，逆轉錄酶以PBS為引物，RTT為模板，合成編輯鏈；此時這時切口上出現2種不同的序列，一條是帶有目標突變的DNA，一條是原DNA鏈，這2條鏈競爭性的結合在靶向鏈上，形成3'或5'flap；最后，若帶有目的突變的DNA鏈結合在靶向鏈上，則出現DNA互補不配對的情況，此時進行錯配修復機制，將DNA鏈修復為目的編輯序列或原來的序列。

與堿基編輯器（BEs）相比，PrimeEditing具有更廣泛的編輯能力。BEs只能實現4種堿基轉換（如C→T、A→G等），而PE可以完成全部12種堿基變化，包括轉換、顛換、插入和缺失，且編輯精度更高。此外，當需要多堿基編輯或目標位點超出BEs的編輯范圍時，PE更具優勢。

傳統的同源定向修復（HDR）雖然理論上可以實現任意編輯，但它依賴DNA雙鏈斷裂（DSB），容易引發NHEJ修復，導致大量非預期的插入/缺失（indels）。相比之下，PE無需依賴DSB，因此編輯產物的純度更高，副產物更少，在精準基因編輯中表現更優。

優缺點對比

點突變作為基因研究領域的重要突變類型，在疾病機制解析和治療方案開發中發揮著不可替代的關鍵作用。上文詳細介紹了三種點突變構建方法的基本原理及其各自的優缺點，希望能為相關研究提供有價值的參考。