大家在閱讀液相色譜的文章的時(shí)候，經(jīng)常能夠看到各種名字的“體積”，比如死體積、駐留體積、延遲體積、孔隙體積等等，這些“體積”到底都是些什么東西？它們對(duì)我的液相分析到底意味著什么呢？今天我們就看一看經(jīng)常用到的這三個(gè)體積

指的是有效進(jìn)樣點(diǎn)到有效檢測(cè)點(diǎn)之間排除色譜柱中包含固定相部分的體積。包括 4 部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)， Vm ）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有 Vm 參與色譜平衡過(guò)程，其他3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。

系統(tǒng)死體積一般通過(guò)進(jìn)樣基本不保留的小分子來(lái)測(cè)定。尿嘧啶、丙酮和硫脲是反相色譜中最常用的測(cè)試物質(zhì)；死時(shí)間與死體積相關(guān)；可以用死體積除以流速測(cè)定。

▉ 死體積計(jì)算

對(duì)于HPLC來(lái)說(shuō)，該如何計(jì)算死體積呢。

死體積(dead volume,V0)——由進(jìn)樣器進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池未被固定相所占據(jù)的空間。它包括4部分：進(jìn)樣器至色譜柱管路體積、柱內(nèi)固定相顆粒間隙（被流動(dòng)相占據(jù)，Vm）、柱出口管路體積、檢測(cè)器流動(dòng)池體積。其中只有Vm參與色譜平衡過(guò)程，其它3部分只起峰擴(kuò)展作用。為防止峰擴(kuò)展，這3部分體積應(yīng)盡量減小。

死時(shí)間(dead time,t0)——不保留組分的保留時(shí)間。即流動(dòng)相（溶劑）通過(guò)色譜柱的時(shí)間。

測(cè)量系統(tǒng)死體積通常需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量，常用方法是通過(guò)進(jìn)一針和色譜柱固定相沒(méi)有任何作用的特殊溶液時(shí)，就會(huì)得到一個(gè)色譜峰，由此峰可以測(cè)得死時(shí)間（t0），這就是t0的實(shí)測(cè)結(jié)果。

然后通過(guò)計(jì)算得到系統(tǒng)死體積:

死體積（V0) = 死時(shí)間t0×流動(dòng)相的流速F。

▉ 減少死體積

在我們使用或維護(hù)的過(guò)程中，如果涉及管路等配件的更換，應(yīng)該選擇與原規(guī)格一致的配件，以確保死體積與原來(lái)一致，避免死體積的增加而帶來(lái)峰形的展寬。

接裝色譜柱時(shí)，需確保管線接頭匹配完好（特別注意peek管接頭的使用，以及管線與色譜柱的連接處）避免形成接頭空腔（如下圖）

▉那什么時(shí)候應(yīng)選擇哪種接頭？

PEEK 和聚酮接頭尤為適用于需要經(jīng)常更換的連接，或需要生物兼容性時(shí)。也在對(duì)壓力要求不高時(shí)使用，如色譜柱的出口接頭。PEEK 接頭的最高使用壓力為 200 bar，聚酮接頭為 600 bar。

▉駐留體積的定義

駐留體積是指溶劑首次混合點(diǎn)（通常在液相色譜儀的混合腔內(nèi)或比例閥中）與液相色譜柱頭之間的體積。其中，低壓混合系統(tǒng)的駐留體積等于從比例閥經(jīng)泵和其他系統(tǒng)組件到柱頭的體積總和。高壓混合系統(tǒng)的駐留體積等于從溶劑首次混合點(diǎn)，經(jīng)過(guò)兩個(gè)計(jì)量泵再到柱頭的體積總和。

在等度分離中，駐留體積對(duì)保留時(shí)間沒(méi)有任何影響，而在梯度分離中則會(huì)造成重大影響。若不了解系統(tǒng)的駐留體積，可能會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重影響，因?yàn)轳v留體積有可能遠(yuǎn)大于色譜柱體積。

▉相同色譜柱，不同儀器

若想在不同儀器上使用相同尺寸的色譜柱，往往需要考慮駐留體積這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)椴煌v留體積的儀器使用同一方法也可能影響分析結(jié)果。在柱頭開(kāi)始梯度洗脫時(shí)，需要確保通過(guò)色譜柱的流動(dòng)相體積相同。如果流動(dòng)相的體積不相同，結(jié)果也將不同。

若在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對(duì)不同駐留體積的 HPLC 儀器使用相同的方法，運(yùn)行結(jié)果很可能不完全相同，因?yàn)閮煞N（或多種）流動(dòng)相混合形成梯度后，將在各個(gè)儀器的流路內(nèi)經(jīng)過(guò)一段不同的時(shí)間后方能到達(dá)柱頭。因此，進(jìn)樣后受時(shí)間影響，分析物將通過(guò)不同的流動(dòng)相組分，其保留時(shí)間和分離度也會(huì)受到影響。如果將梯度方法從一臺(tái)儀器轉(zhuǎn)移到另一臺(tái)儀器，保留時(shí)間會(huì)根據(jù)兩個(gè)系統(tǒng)的駐留體積發(fā)生變化。流路體積越接近，結(jié)果的一致性越高。

結(jié)果如有差異，可采用多種方法加以糾正。若儀器的駐留體積較小，可以通過(guò)增加儀器的體積來(lái)調(diào)節(jié)駐留體積；若儀器的駐留體積較大，可以減小儀器連接管線的內(nèi)徑和長(zhǎng)度。此外，還可以在該方法中設(shè)置梯度延遲，以補(bǔ)償流路系統(tǒng)中的不同駐留時(shí)間。

▉ 延遲體積

延遲體積指的是溶劑混合點(diǎn)（通常在液相色譜儀的混合腔內(nèi)或比例閥中）與 LC 柱頭之間的體積。

在梯度洗脫或等度洗脫的溶劑組成改變時(shí)，延遲體積對(duì)于使色譜柱在盡可能短的時(shí)間內(nèi)完成流動(dòng)相組成的變化非常重要。低壓混合物系統(tǒng)的駐留體積一般比高壓混合系統(tǒng)大。

▉ 減少延遲體積

由于不同儀器的延遲體積不同，在運(yùn)行梯度方法時(shí)，可能會(huì)對(duì)分離度及保留時(shí)間造成影響，并進(jìn)一步可能會(huì)對(duì)方法轉(zhuǎn)移或驗(yàn)證造成影響。

延遲體積越大，可能造成的影響越大。越大的延遲體積，改變梯度比例后到達(dá)色譜柱的時(shí)間就越長(zhǎng)，尤其是在低流速下。

減小不同滯留體積對(duì)分離效果影響的辦法主要有三種：

• 第一（最好的），某些系統(tǒng)控制器可以在梯度開(kāi)始后的精確時(shí)間進(jìn)樣。如延遲進(jìn)樣時(shí)間tD，梯度和樣品可同時(shí)到達(dá)柱進(jìn)口。
• 第二，如梯度過(guò)程開(kāi)始可插入一段等度過(guò)程，用VD值較大的系統(tǒng)時(shí)則可以縮短這一過(guò)程；而用VD值較小的系統(tǒng)時(shí)則可延長(zhǎng)這一過(guò)程。以此方式，樣品和梯度則會(huì)同時(shí)達(dá)到柱進(jìn)口。
• 第三，以一較陡梯度從5%B至初始%B開(kāi)始。