多索茶堿（Doxofylline）主要用于支氣管痙攣引起的呼吸困難，作為新一代茶堿藥物，其具有療效高、副作用小等特點(diǎn)；但該藥與茶堿一樣，同樣存在個(gè)體差異較大，大劑量給藥時(shí)可能引起血壓下降、心律不齊、陣發(fā)性痙攣等不良反應(yīng)，故臨床需密切監(jiān)測(cè)血藥濃度。目前，檢測(cè)血藥濃度主要采用高效液相色譜（HPLC）法，但傳統(tǒng)的HPLC法存在前處理較復(fù)雜、常使用大量有機(jī)溶劑、殘留蛋白易堵塞色譜柱等問(wèn)題。本研究對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行優(yōu)化和改良，建立了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，適用于臨床該藥的血藥濃度檢測(cè)。

#方法

01

色譜條件

第二維色譜系統(tǒng)為島津LC-20ATvp四元低壓色譜泵，色譜柱為Waters C18（150 mm×4.6 mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30，V/V），流速為1.0mL/min，中間柱SC2（25 mm×3.5 mm，5 μm）；第一維色譜系統(tǒng)為島津LC-20ATvp一元低壓色譜泵，流動(dòng)相為甲醇-水（70:30，V/V），不需要色譜柱，主要用于清洗中間柱；FLC-2801全自動(dòng)二維液相色譜耦合儀檢測(cè)波長(zhǎng)為273nm；柱溫為40 ℃。

工作原理如下圖：

A.進(jìn)樣：目標(biāo)經(jīng)過(guò)中間柱分離雜質(zhì)后進(jìn)入分析柱進(jìn)行分析

B.除雜：中間柱在目標(biāo)物完全離開(kāi)后轉(zhuǎn)至第二維柱系統(tǒng)進(jìn)行反向沖洗，洗去殘留雜質(zhì)

C.返回：中間柱洗凈后返回第一維柱系統(tǒng)，為下一次進(jìn)樣做準(zhǔn)備

在線二維柱切換-HPLC條件設(shè)置-時(shí)間程序表見(jiàn)表1。

表1 在線二維柱切換-HPLC條件設(shè)置-時(shí)間程序表

02

溶液的制備

對(duì)照品貯備液、對(duì)照品溶液使用25％乙醇溶解配制。質(zhì)控樣品溶液、標(biāo)曲樣品溶液使用空白馬血清稀釋配制（低、中、高質(zhì)控濃度分別為37.5、12.5、1.5 μg/mL）。

03

血清樣品處理

全血樣品以3000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，精密量取待測(cè)血清樣品200μL，加入10％高氯酸600μL，渦旋振蕩1min后，以14500r/min轉(zhuǎn)速離心8min，取上清液700μL至進(jìn)樣瓶，加入5.0mol/L磷酸銨溶液70μL調(diào)節(jié)pH至7.0，渦旋振蕩15s，進(jìn)樣10μL，以外標(biāo)法定量分析。

#結(jié)果

01

專(zhuān)屬性

各空白樣品目標(biāo)峰處無(wú)干擾，多索茶堿與雜質(zhì)分離較好，保留時(shí)間為8.794 min。

圖2 專(zhuān)屬性HPLC

02

線性關(guān)系考察

標(biāo)曲各點(diǎn)索茶堿質(zhì)量濃度分別為50.0、25.0、12.5、6.25、3.0、1.5、0.5 μg/mL，繪制標(biāo)曲擬合回歸方程為y＝32015x+1669.85（r＝0.9999），線性范圍 0.5～50.0 μg/mL。

檢測(cè)限與定量限考察：以信噪比為3計(jì)算檢測(cè)限，以信噪比為10計(jì)算定量限，結(jié)果顯示檢測(cè)限為0.01 μg/mL，定量限為0.5 μg/mL。

03

準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表2

表2 準(zhǔn)確度與精密度試驗(yàn)結(jié)果（x的平均值±s，n＝5）

04

提取回收率試驗(yàn)

高、中、低質(zhì)控樣品溶液的提取回收率分別為93.44％、92.25％、91.63％，RSD分別為1.9％、1.1％、1.8％（n＝3），表明本方法的提取回收率較高且穩(wěn)定。

05

基質(zhì)效應(yīng)考察

取6份不同的空白人血清和空白馬血清，處理后加入多索茶堿對(duì)照品溶液制備成高、低濃度（37.5、1.5 μg/mL）質(zhì)控樣品溶液并測(cè)試，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3

表3 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果（x的平均值±s，n＝6）

06

穩(wěn)定性考察

高、中、低質(zhì)控樣品，在室溫放置0、2、4、8、16、24h及冷凍保存10 d（反復(fù)凍融3次）后，按血清樣品處理并測(cè)試，結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品溶液峰面積的RSD均＜5.00％（n＝6），表明質(zhì)控樣品溶液在室溫放置24 h及冷凍10d的穩(wěn)定性良好。

07

臨床樣本測(cè)定

取3例用藥患者的全血樣品，處理后進(jìn)樣分析，計(jì)算濃度。結(jié)果顯示，3例用藥患者的多索茶堿血藥濃度分別為3.23、3.35、3.68μg/mL，RSD分別為2.28％、2.34％、2.14％（n＝5），血藥濃度均在本方法檢測(cè)范圍內(nèi)，且重現(xiàn)性較好。

本方法采用高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，不但避免有機(jī)溶劑萃取造成樣品的損失，而且不需要用微孔濾膜過(guò)濾，簡(jiǎn)化了樣品處理過(guò)程，縮短了樣本處理時(shí)間。此外，本方法提取回收率高，回收率穩(wěn)定，不需要加入內(nèi)標(biāo)，通過(guò)外標(biāo)法就能達(dá)到較好的線性關(guān)系。與文獻(xiàn)方法比較，該方法試驗(yàn)步驟更為簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、方法線性好、干擾少、準(zhǔn)確，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測(cè)。