多索茶堿（Doxofylline）主要用于支氣管痙攣引起的呼吸困難，作為新一代茶堿藥物，其具有療效高、副作用小等特點；但該藥與茶堿一樣，同樣存在個體差異較大，大劑量給藥時可能引起血壓下降、心律不齊、陣發性痙攣等不良反應，故臨床需密切監測血藥濃度。目前，檢測血藥濃度主要采用高效液相色譜（HPLC）法，但傳統的HPLC法存在前處理較復雜、常使用大量有機溶劑、殘留蛋白易堵塞色譜柱等問題。本研究對傳統方法進行優化和改良，建立了一種簡便、快速、準確的檢測方法，適用于臨床該藥的血藥濃度檢測。

#方法

01

色譜條件

第二維色譜系統為島津LC-20ATvp四元低壓色譜泵，色譜柱為Waters C18（150 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-水（70∶30，V/V），流速為1.0mL/min，中間柱SC2（25 mm×3.5 mm，5 μm）；第一維色譜系統為島津LC-20ATvp一元低壓色譜泵，流動相為甲醇-水（70:30，V/V），不需要色譜柱，主要用于清洗中間柱；FLC-2801全自動二維液相色譜耦合儀檢測波長為273nm；柱溫為40 ℃。

工作原理如下圖：

A.進樣：目標經過中間柱分離雜質后進入分析柱進行分析

B.除雜：中間柱在目標物完全離開后轉至第二維柱系統進行反向沖洗，洗去殘留雜質

C.返回：中間柱洗凈后返回第一維柱系統，為下一次進樣做準備

在線二維柱切換-HPLC條件設置-時間程序表見表1。

表1 在線二維柱切換-HPLC條件設置-時間程序表

02

溶液的制備

對照品貯備液、對照品溶液使用25％乙醇溶解配制。質控樣品溶液、標曲樣品溶液使用空白馬血清稀釋配制（低、中、高質控濃度分別為37.5、12.5、1.5 μg/mL）。

03

血清樣品處理

全血樣品以3000r/min轉速離心5min，精密量取待測血清樣品200μL，加入10％高氯酸600μL，渦旋振蕩1min后，以14500r/min轉速離心8min，取上清液700μL至進樣瓶，加入5.0mol/L磷酸銨溶液70μL調節pH至7.0，渦旋振蕩15s，進樣10μL，以外標法定量分析。

#結果

01

專屬性

各空白樣品目標峰處無干擾，多索茶堿與雜質分離較好，保留時間為8.794 min。

圖2 專屬性HPLC

02

線性關系考察

標曲各點索茶堿質量濃度分別為50.0、25.0、12.5、6.25、3.0、1.5、0.5 μg/mL，繪制標曲擬合回歸方程為y＝32015x+1669.85（r＝0.9999），線性范圍 0.5～50.0 μg/mL。

檢測限與定量限考察：以信噪比為3計算檢測限，以信噪比為10計算定量限，結果顯示檢測限為0.01 μg/mL，定量限為0.5 μg/mL。

03

準確度與精密度試驗

結果見表2

表2 準確度與精密度試驗結果（x的平均值±s，n＝5）

04

提取回收率試驗

高、中、低質控樣品溶液的提取回收率分別為93.44％、92.25％、91.63％，RSD分別為1.9％、1.1％、1.8％（n＝3），表明本方法的提取回收率較高且穩定。

05

基質效應考察

取6份不同的空白人血清和空白馬血清，處理后加入多索茶堿對照品溶液制備成高、低濃度（37.5、1.5 μg/mL）質控樣品溶液并測試，計算基質效應，結果見表3

表3 基質效應考察結果（x的平均值±s，n＝6）

06

穩定性考察

高、中、低質控樣品，在室溫放置0、2、4、8、16、24h及冷凍保存10 d（反復凍融3次）后，按血清樣品處理并測試，結果顯示，質控樣品溶液峰面積的RSD均＜5.00％（n＝6），表明質控樣品溶液在室溫放置24 h及冷凍10d的穩定性良好。

07

臨床樣本測定

取3例用藥患者的全血樣品，處理后進樣分析，計算濃度。結果顯示，3例用藥患者的多索茶堿血藥濃度分別為3.23、3.35、3.68μg/mL，RSD分別為2.28％、2.34％、2.14％（n＝5），血藥濃度均在本方法檢測范圍內，且重現性較好。

本方法采用高氯酸沉淀蛋白后直接進樣，不但避免有機溶劑萃取造成樣品的損失，而且不需要用微孔濾膜過濾，簡化了樣品處理過程，縮短了樣本處理時間。此外，本方法提取回收率高，回收率穩定，不需要加入內標，通過外標法就能達到較好的線性關系。與文獻方法比較，該方法試驗步驟更為簡單、檢測時間短、方法線性好、干擾少、準確，適用于臨床多索茶堿的血藥濃度檢測。