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Part I

基質(zhì)膠——常識(shí)篇

1

基質(zhì)膠分類

基質(zhì)膠主要分為5大類（表1），分別為標(biāo)準(zhǔn)型（Standard）、細(xì)胞因子減少型（Growth Factor Reduced, GFR）、高濃度型（High Concentration, HC）、類器官專用型（Organoid）和干細(xì)胞專用型（Embryonic Stem Cell, ESC）。

2

應(yīng)該采購(gòu)哪一款的基質(zhì)膠？

2.1標(biāo)準(zhǔn)型基質(zhì)膠適用于適用于極化細(xì)胞的培養(yǎng)，如上皮細(xì)胞。促進(jìn)多種類型細(xì)胞的分化，包括肝細(xì)胞、神經(jīng)元、β-胰島細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。例如侵襲實(shí)驗(yàn)、成管實(shí)驗(yàn)等。

2.2細(xì)胞因子減少型基質(zhì)膠適用要求基質(zhì)膠成分相對(duì)明確的實(shí)驗(yàn)，例如類器官培養(yǎng)、血管生成、干細(xì)胞培養(yǎng)等。

2.3高濃度型基質(zhì)膠適用于體內(nèi)成瘤（CDX、PDX和PDOX）和體內(nèi)血管生成（Plug Aassay）等。高濃度基質(zhì)膠成膠速度快，凝膠剛性高，具有更好的支架效果（Cell Scaffold）。

2.4類器官專用型基質(zhì)膠屬于細(xì)胞因子減少型亞類，有較高濃度和剛性，且通過(guò)小鼠小腸類器官培養(yǎng)測(cè)試，能再現(xiàn)小腸類器官出芽表型和分子標(biāo)志物表達(dá)特征。

2.5胚胎干細(xì)胞專用型基質(zhì)膠是經(jīng)驗(yàn)證具有特定培養(yǎng)基兼容性，且穩(wěn)定維持干細(xì)胞形狀和干性的基質(zhì)膠。

• 表1基質(zhì)膠分類和應(yīng)用場(chǎng)景

3

基質(zhì)膠保存、解凍、運(yùn)輸和分裝？

• 保存：基質(zhì)膠通常保存于-20℃的無(wú)除霜功能冰箱；
  

• 解凍：將基質(zhì)膠包裝瓶半埋于碎冰中，置于2-8℃冰箱過(guò)夜；

• 運(yùn)輸：干冰物流運(yùn)輸；

• 分裝：結(jié)合每輪實(shí)驗(yàn)基質(zhì)膠使用量進(jìn)行分裝，分裝后于-20℃的無(wú)除霜功能冰箱保存，避免反復(fù)凍融。
  

4

使用基質(zhì)膠前需要試劑和耗材預(yù)冷嗎？

由于基質(zhì)膠在高于8℃的環(huán)境溫度下就會(huì)以不可逆形式聚合形成凝膠，所以在操作基質(zhì)膠過(guò)程中，試劑（培養(yǎng)液、稀釋液、細(xì)胞懸液等）和耗材（吸頭、培養(yǎng)皿、EP管和管架等）都要求預(yù)冷，冰上操作。

5

基質(zhì)膠顏色和狀態(tài)？

凍存狀態(tài)下，含酚紅基質(zhì)膠顏色通常為淺橘紅色，不含酚紅基質(zhì)膠呈現(xiàn)碎冰樣白色；解凍后，含酚紅基質(zhì)膠紫紅色。解凍后不含酚紅高濃度基質(zhì)膠為半透明濃稠濁液，低濃度基質(zhì)膠為近乎透明狀液體。

6

基質(zhì)膠出現(xiàn)沉淀怎么辦？

如發(fā)現(xiàn)基質(zhì)膠存在少量沉淀，建議4℃低速離心后使用，通常不影響基質(zhì)膠活性。

7

包被培養(yǎng)皿時(shí)，基質(zhì)膠使用量？

• 表2基質(zhì)膠包被培養(yǎng)皿用量指導(dǎo)

Part II

基質(zhì)膠——實(shí)驗(yàn)篇

1

內(nèi)皮細(xì)胞生成實(shí)驗(yàn)（Tube Formation Assay）

1.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

血管形成實(shí)驗(yàn)是體外研究血管生成的經(jīng)典方法，該方法可快速確定調(diào)控血管生成的基因、小分子或信號(hào)通路，結(jié)合鈣黃綠素（Calcein）染色和Image J分析工具，可以實(shí)現(xiàn)血管生成的定量分析。

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1包被：基質(zhì)膠解凍后，按照每孔50-60μl的量加入預(yù)冷96孔板培養(yǎng)孔中(盡量避免基質(zhì)膠產(chǎn)生氣泡)，并輕輕搖晃培養(yǎng)板，使基質(zhì)膠均勻鋪于培養(yǎng)孔孔底；然后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱聚合30min。

1.2.2細(xì)胞制備：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)中的HUVEC細(xì)胞消化，制備成2E+5cell/ml懸液（計(jì)數(shù)一定要準(zhǔn)確）。

1.2.3接種：細(xì)胞混勻計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞接種至已報(bào)備培養(yǎng)孔中，每孔100μl，輕輕搖勻后，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4觀察：培養(yǎng)6h（或其他指定時(shí)間點(diǎn)）節(jié)后，顯微鏡下觀察成管情況，同時(shí)采集照片。

1.3 注意事項(xiàng)

1.4.1血管內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)推薦使用奧格諾德標(biāo)準(zhǔn)型（貨號(hào)：111105）或細(xì)胞因子減少型（貨號(hào)：121105）基質(zhì)膠，膠濃度為8-10mg/ml最佳。

1.4.2體外血管形成實(shí)驗(yàn)除了選好合適的基質(zhì)膠之外，內(nèi)皮細(xì)胞的狀態(tài)也極為關(guān)鍵，建議選擇3-5代次的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，鋪板接種前注意細(xì)胞狀態(tài)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）并進(jìn)行饑餓培養(yǎng)。同時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量不能過(guò)稀或者過(guò)密。

1.4結(jié)果示例

2

侵襲實(shí)驗(yàn)（Invasion）

2.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)是體外模擬細(xì)胞主動(dòng)突破物理屏障發(fā)生位置轉(zhuǎn)移能力的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力探索研究中，結(jié)合結(jié)晶紫染色可實(shí)現(xiàn)定量分析。應(yīng)用于炎癥反應(yīng)、癌癥轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育、血管生成、傷口愈合、免疫反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等研究領(lǐng)域

2.2實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1基質(zhì)膠稀釋：基質(zhì)膠解凍后，將基質(zhì)膠用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至1mg/ml左右，混勻后冰置于上備用。

2.2.2小室鋪膠：按照每小室60μl的量將稀釋后的基質(zhì)膠垂直加入預(yù)冷小室底部，不要產(chǎn)生氣泡，然后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2-3h，使基質(zhì)膠充分聚合為薄膜層。

2.2.3基底膜水化：孵育后將小室中多余液體小心吸掉，加入100μl無(wú)血清培養(yǎng)基，然后置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30min，使基底膜充分水化。

2.2.4檢漏：小心吸出小室中液體，檢查是否有液體穿過(guò)小室進(jìn)入下室中，若漏液則可用于下游細(xì)胞接種。

2.2.5細(xì)胞制備：消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期待檢測(cè)細(xì)胞，清洗后細(xì)胞重懸計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1-10E+5cell/ml（根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞密度）；在24孔板下室加入600μl含5%-10%FBS或趨化因子的培養(yǎng)基，然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，取適量細(xì)胞懸液（100-200μl）加入上室，最后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-48h（細(xì)胞量和時(shí)間視細(xì)胞侵襲能力變化，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）；同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，下室添加等體積無(wú)血清培養(yǎng)基。

2.2.6固定：在指定時(shí)間點(diǎn)，取出Transwell小室，去除培養(yǎng)液，用PBS浸濕的棉簽或棉花輕輕擦拭小室內(nèi)基質(zhì)膠和細(xì)胞。在24孔板干凈的孔中加入600μl 4%多聚甲醛固定液，將小室放入固定30min。然后棄固定液，PBS洗滌小室內(nèi)外1次。

2.2.7結(jié)晶紫染色：在24孔板干凈的孔中加入600μl結(jié)晶紫染色液，將小室放入染色10min。

2.2.8取出小室，PBS洗滌小室內(nèi)外3次。適當(dāng)風(fēng)干后，顯微鏡下觀察定性研究；取3-5個(gè)視野拍照后。

2.2.9定量分析：用Image J計(jì)數(shù)取平均值進(jìn)行定量研究。

2.3注意事項(xiàng)

2.3.1根據(jù)細(xì)胞大小選擇合適的Transwell chamber小室，常用的為8μm孔徑，細(xì)胞培養(yǎng)板有6-，12-和24-孔板等，最常用的是24孔板。

2.3.2接種細(xì)胞狀態(tài)和密度非常關(guān)鍵，需結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定接種數(shù)量以及后續(xù)檢測(cè)固定染色時(shí)間點(diǎn)。

2.4結(jié)果示例

3

皮下成瘤（Xenograft）

3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

皮下成瘤實(shí)驗(yàn)為腫瘤發(fā)生發(fā)展研究和腫瘤藥物開(kāi)發(fā)奠定了疾病模型基礎(chǔ)，被廣發(fā)應(yīng)用于各種腫瘤發(fā)病機(jī)制研究。高濃度基質(zhì)膠有效促進(jìn)腫瘤形成，為腫瘤細(xì)胞提供合適的生長(zhǎng)微環(huán)境。

3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

3.2.1選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞匯合度達(dá)80-90%左右為宜；

3.2.2消化細(xì)胞后用預(yù)冷的PBS洗兩遍，目的為去除細(xì)胞中殘余的血清和胰酶。

3.2.3細(xì)胞用預(yù)冷PBS或無(wú)血清培養(yǎng)重懸，計(jì)數(shù)并根據(jù)需求調(diào)整細(xì)胞密度。細(xì)胞懸液與高濃度基質(zhì)膠1:1混勻。一般皮下瘤接種的細(xì)胞量為1-5×10^6個(gè)細(xì)胞/鼠，接種體積為0.1-0.2ml。

3.2.4裸鼠周齡4-6周齡，體重16-18g左右，種植部位選擇血供豐富區(qū)域，如腋下中后部；

3.2.5從進(jìn)針部位向前穿刺大約1cm，進(jìn)行皮下注射，針頭在皮下左右滑動(dòng)幾次，以便細(xì)胞接種成團(tuán)，避免注射后細(xì)胞懸液從針眼溢出；

3.2.6接種后正常飼養(yǎng)，4-6周成瘤，過(guò)程中檢測(cè)小鼠體重，腫瘤體積變化；最后取瘤進(jìn)行拍照成像，保存組織用于下游實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

3.3 注意事項(xiàng)

3.3.1細(xì)胞與基質(zhì)膠混勻后，需置于冰上放置，并盡快注射，避免基質(zhì)膠聚合；同時(shí)低溫能降低細(xì)胞代謝，維持細(xì)胞活力。

3.3.2不同細(xì)胞成瘤能力也不同，所以細(xì)胞接種數(shù)量需結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳值。

3.3.3稀釋后的基質(zhì)膠濃度不可低于4mg/ml。

3.4 結(jié)果示例

4

基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)（Matrigel Plug Assay）

4.1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)是體內(nèi)探究血管生成的一種技術(shù)，可用于分析調(diào)控血管生成的基因、小分子或者信號(hào)通路，結(jié)合病理染色實(shí)驗(yàn)?zāi)軐?shí)現(xiàn)血管生成的定性和定量檢測(cè)。

4.2實(shí)驗(yàn)步驟

4.2.1從-20℃把冰箱取出奧格諾德高濃度基質(zhì)膠，將其半埋于碎冰之中，置于4℃冰箱過(guò)夜解凍。

4.2.2將EP管、注射器、針頭、吸管等置于4℃或冰上預(yù)冷，避免后續(xù)基質(zhì)膠操作過(guò)程中提前聚合凝膠。

4.2.3將500μl高濃度基質(zhì)膠轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，并添加待測(cè)藥品（小分子化合物和蛋白等），充分混勻后置于冰上。

4.2.4麻醉小鼠（注射阿佛丁或其他吸入式麻醉）。麻醉后剃毛刀剃出小鼠身體一側(cè)待注射位置毛發(fā)，酒精棉擦拭消毒備用。

4.2.5在備皮處進(jìn)行皮下注射，注射時(shí)速度切記不要太快，慢慢推進(jìn)給藥；注射后7-15d形成基質(zhì)膠塞，并血管化。

4.2.6血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉處死小鼠，取出基質(zhì)膠塞，置于DMEM中，去除基質(zhì)膠塞表面粘附的其他組織，然后于PBS中再次清洗。

4.2.7圖像采集與樣本保存：清洗干凈后拍照保存，膠塞的紅色程度代表血管生成的水平；樣本保存后，可以用于病理染色分析血管形成的組織形態(tài)。

4.3結(jié)果示例

Akhtar N, Dickerson EB, Auerbach R. The sponge/Matrigel angiogenesis assay[J]. Angiogenesis, 2002, 5: 75-80.

5

類器官培養(yǎng)（Organoids）

奧格諾德類器官專用基質(zhì)膠用于小鼠正常類器官培養(yǎng)

6

干細(xì)胞培養(yǎng)（Stem cell）

奧格諾德干細(xì)胞專用基質(zhì)膠用于iPS細(xì)胞培養(yǎng)

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