研究背景

膠質母細胞瘤是成人最具侵襲性的原發性腦癌，三分之二的患者對當前標準治療系統療法具有先天耐藥性。盡管免疫檢查點抑制劑在黑色素瘤腦轉移等病理中表現出顯著的顱內活性，但膠質母細胞瘤對單藥免疫檢查點阻斷具有耐藥性。為了更好地理解膠質母細胞瘤對免疫檢查點抑制劑的分子反應，并識別可靶向的免疫逃逸途徑，該研究團隊之前曾報道了一項關于新輔助和單獨輔助帕博利珠單抗（pembrolizumab）的隨機手術窗口試驗，研究對象為接受手術切除的復發性膠質母細胞瘤患者。通過對比新輔助與未經新輔助治療的腫瘤基因表達譜，該研究發現了一個分子反應特征，包括細胞周期/癌癥增殖基因的下調和T細胞/干擾素γ相關基因的上調。細胞周期基因特征與總生存期呈負相關。重要的是，與單獨輔助使用帕博利珠單抗相比，新輔助治療的加入與總生存期的顯著延長有關。在此，該研究團隊報告了一項單臂、非隨機新輔助帕博利珠單抗擴展隊列研究的結果（NCT02852655），以增強對帕博利珠單抗腫瘤分子反應及其對總生存期影響的藥效學終點的觀察。

研究結果

為了確認帕博利珠單抗在膠質母細胞瘤中的藥效學效應，該研究設計了一個擴展隊列，以補充完善之前報道的多中心、隨機、開放標簽的手術研究的藥效學終點，該研究比較了新輔助聯合輔助帕博利珠單抗（新輔助組）與單獨輔助帕博利珠單抗（輔助組）在復發性膠質母細胞瘤患者中的療效。所有患者均被分配到新輔助組，并在手術切除腫瘤前約14天接受單劑量帕博利珠單抗治療，手術恢復后每3周接受一次帕博利珠單抗治療，直至疾病進展或出現不可接受的毒性。2020年6月至2021年8月期間，共有25名患者在四個機構入組，構成了意向治療人群。

在初步研究中，帕博利珠單抗治療導致細胞周期/癌癥增殖基因特征的減少和T細胞/干擾素γ特征的增加。細胞周期/癌癥增殖基因特征與生存期呈負相關。當前擴展隊列的主要目標是增強這一觀察結果，并觀察帕博利珠單抗是否會導致細胞周期/癌癥增殖相關基因表達減少的這一假設。該研究對擴展的新輔助隊列的切除腫瘤組織進行了批量RNA測序（RNAseq），并與臨床試驗第一階段的基因表達數據合并，作為該擴展研究的預設主要終點（圖1a）。

臨床試驗達到了其主要藥效學終點，綜合基因表達分析發現，在新輔助隊列中，帕博利珠單抗治療的腫瘤組織中細胞周期/癌癥增殖相關絕對富集評分的中位數顯著降低至-0.2996（四分位間距-0.5853至0.2040），而未治療的腫瘤組織中為0.5172（四分位間距0.0712-0.6579），p=0.009（圖1b）。有趣的是，擴展隊列中細胞周期基因集下調的程度并不像初始隊列中那么顯著。合并隊列還顯示，與未治療的腫瘤組織相比，帕博利珠單抗治療的腫瘤組織中T細胞/IFN基因特征的富集呈現異質性（圖1c，p=0.08）。對兩個新輔助隊列分別進行分析，與輔助組相比，細胞周期和干擾素γ相關基因表達變化的模式相同，但擴展新輔助隊列并未達到統計學顯著性。

與初始研究一樣，相對于僅接受輔助治療隊列，新輔助帕博利珠單抗治療并未誘導腫瘤浸潤性淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）的統計學顯著增加。這些發現證實了PD1導向免疫檢查點抑制劑對膠質母細胞瘤基因表達模式的藥效學效應，但提示可能存在某些機制，通過防止T細胞浸潤或抑制腫瘤微環境中TIL功能，從而介導先天耐藥性，正如該研究團隊近期研究所示。

為了開發一個能夠預測這些患者臨床過程的生物標志物，該研究團隊使用Cox比例風險模型識別在新輔助隊列中差異表達的基因特征，并且這些特征也與生存期獨立相關。細胞周期基因特征（Farmers_Breast_Cancer_Cluster_2）被新輔助帕博利珠單抗治療下調，并被發現是總生存期的獨立風險因素（圖1d），風險比（HR）為3.54，置信區間（CI）為[1.17–10.65]，p=0.025。將細胞周期基因特征（Farmers_Breast_Cancer_Cluster_2）加入Cox模型顯著提高了總生存期的可解釋方差（即R平方），從32%提高到45%，這與該研究團隊在初始報告中的發現一致。有趣的是，干擾素γ相關基因集（Ayers_et_al_IFN_genes）與生存期并未獨立相關，風險比為0.93，置信區間為[0.32-2.70]，p=0.893，這表明I型和II型干擾素可能難以區分，可能代表介導對免疫檢查點抑制劑先天耐藥性的慢性炎癥。在該隊列中，注冊時的總類固醇劑量是唯一與生存期顯著相關的臨床因素，與細胞周期基因共同成為此隊列的顯著預后因素（圖1d，風險比1.44，置信區間[1.06–1.95]，p=0.021）。通過CybersortX對批量基因表達數據進行解卷分析顯示，細胞周期基因特征的變化顯著且直接與腫瘤分數相關，而T細胞/IFN基因表達變化與髓系分數相關(圖1e，f)。這些發現表明，抗PD1免疫檢查點阻斷在膠質母細胞瘤中觸發的細胞周期基因抑制是由腫瘤細胞驅動的，并且與這些患者的生存期獨立相關。

圖1：帕博利珠單抗治療與T細胞/干擾素-γ基因相關特征增加以及細胞周期/癌癥增殖基因特征減少有關

在意向治療分析中，新輔助擴展隊列的中位總生存期為204天（6.8個月），而初始新輔助隊列為417天（13.7個月），初始僅輔助隊列為228天（7.5個月）。新輔助擴展隊列的中位無進展生存期為75天（2.5個月），而初始新輔助隊列為99.5天（3.3個月），初始僅輔助治療隊列為72.5天（2.5個月）。該研究的次要終點PFS-6在新輔助擴展隊列為0%，而之前報道的初始新輔助隊列為33.3%（95%置信區間：16.3%-68.2%）。合并新輔助隊列的PFS-6為19.5%（95%置信區間：9.29%-41.2%），而僅輔助隊列為13.3%（95%置信區間：3.67%-48.4%）。三個隊列之間在總生存或無進展生存方面沒有差異（p>0.05和p=0.0543，分別為Mantel-Cox檢驗）。在經過手術且組織學證實為復發性膠質母細胞瘤的患者中（mITT），新輔助擴展隊列的中位總生存期為209.5天（7.0個月），而初始新輔助隊列為400天（13.2個月），初始僅輔助治療隊列為192天（6.3個月）。

圖2：臨床試驗設計和生存結果

與該研究團隊的隨機試驗中的初始新輔助隊列相比，擴展新輔助隊列的總生存期較為有限，但藥效學終點表明，新輔助帕博利珠單抗劑量并未像初始隊列中那樣顯著下調腫瘤細胞周期基因。為了進一步評估這些基因表達變化相關的生物學和臨床結果，該研究團隊根據患者的中位細胞周期/癌癥增殖和T細胞/干擾素γ相關基因特征將患者分為四組。事后分析顯示，這四組之間的總生存期存在顯著差異（圖3c，logrank檢驗，p值<0.0001）。此外，四組中新輔助與輔助患者的分布差異顯著（圖3b，卡方檢驗，p=0.027）。有趣的是，所有具有干擾素高和細胞周期低基因特征的亞組（第3組）的患者均接受了新輔助帕博利珠單抗治療（13/13患者），并且與其它亞組相比具有顯著更長的生存期，為420天（13.8個月）（圖3b，c）。與“細胞周期高”患者相比，“細胞周期低”組的總生存期有所改善，而“細胞周期高”患者顯示出最短的生存時間（第2組和第4組）。將細胞周期和干擾素特征均被分類為高的患者（第4組）的生存期最短，死亡風險比為7.46（置信區間1.22–45.46，p值=0.029）。與低干擾素/T細胞特征的腫瘤相比，高干擾素/T細胞特征的腫瘤具有顯著更高的TIL密度（圖3e，f）。

為了探究導致這干擾素高組（第3組和第4組）之間生存期巨大差異的生物學過程，該研究團隊篩選了各種炎癥/免疫激活相關基因特征。發現第4組在STAT3和TNF-α相關基因特征的富集上顯著高于第3組。STAT3和TNF-α的異常激活與腫瘤細胞增殖、侵襲以及免疫抑制細胞群體（如MDSC和調節性T細胞）的招募有關。值得注意的是，STAT3已被鑒定為間質膠質母細胞瘤亞型的主要調節因子。這些發現表明，新輔助抗PD1免疫檢查點阻斷可以觸發腫瘤基因表達狀態的變化，使其呈現低細胞周期/癌癥增殖和高T細胞/干擾素γ相關特征，并且這種表達特征與T細胞浸潤和在帕博利珠單抗治療隊列中最長的生存期相關。
一名患者因切除腫瘤組織的分析未能證實復發性膠質母細胞瘤而被排除在意向治療人群（mITT）之外。三名患者因缺乏隨訪影像學記錄而被iRANO標準排除在PFS分析之外。基線特征在初始和擴展術前隊列之間相似。帕博利珠單抗耐受性良好，該隊列未發現任何新的、意料之外的毒性反應。共有六例3級及以上不良事件，包括腦水腫（2例）、頭痛、疲勞、腎上腺功能不全和甲狀腺功能亢進。

圖3：細胞周期/癌癥增殖以及T細胞和干擾素特征決定了接受新輔助帕博利珠治療的患者的生存組

該研究團隊的擴展隊列中，復發性膠質母細胞瘤患者接受新輔助聯合輔助帕博利珠單抗治療，達到了其主要藥效學終點。合并的基因表達分析表明，帕博利珠單抗的活性在復發性膠質母細胞瘤中具有明確的基因特征，與細胞周期和癌癥增殖基因的減少以及T細胞/干擾素相關基因的增加有關。先前的研究已經表明，腫瘤中干擾素γ的高基線或治療中表達與免疫檢查點抑制劑的反應相關。與該研究團隊關于新輔助帕博利珠單抗的生存優勢的初步報告一致，該研究識別出一個特定的亞組，即13名新輔助隊列中的患者，其特征是高腫瘤干擾素γ特征和低細胞周期特征，該組患者具有非常長的生存期，中位數為13.8個月。同樣，對接受免疫檢查點抑制劑治療的黑色素瘤患者的基線和治療中腫瘤樣本的分析顯示，高干擾素γ特征伴隨G2M檢查點基因的減少與完全和部分臨床反應顯著相關，表明這些是免疫檢查點阻斷獲益的廣泛生物標志物。由于干擾素γ在多種癌癥中誘導細胞周期停滯，免疫細胞衍生的干擾素γ可能是該研究中最長生存期隊列中低細胞周期評分的直接原因。

癌癥被廣泛認為會產生慢性炎癥狀態。這些數據表明，腫瘤微環境中的局部炎癥反應可能是情境性的，因為等比例的患者（未治療與接受新輔助治療的患者）顯示出高細胞周期和高T細胞/IFN轉錄特征。具有這種轉錄模式的患者腫瘤中，STAT-3和TNF信號顯著富集。因此，這些腫瘤可能類似于膠質母細胞瘤的間質亞型，并且表明這種慢性炎癥腫瘤微環境可能對免疫檢查點抑制劑具有固有耐藥性。在其他顱外腫瘤中，通過減少這種慢性炎癥狀態的策略已經取得了成功，并隨后恢復了對免疫檢查點阻斷的反應。

膠質母細胞瘤中的p16-CDK4/6-Rb信號通路作為主要的細胞周期調節因子，其過度激活可能也獨立地為免疫逃逸提供機制。在腫瘤和T細胞中均涉及CDK4/6信號通路，其通過抑制腫瘤內源性抗原處理和呈遞，以及調節T細胞亞群，從而介導免疫逃逸。在黑色素瘤中，CDK4/6抑制劑和免疫檢查點抑制劑的聯合應用被廣泛關注，特別是在CDK4/6過度激活頻繁的腫瘤中，如膠質母細胞瘤。然而，CDK4/6抑制劑abemaciclib與帕博利珠單抗聯合在轉移性乳腺癌的1b期臨床試驗中顯示出高比例的轉氨酶升高和肺炎。目前，關于聯合靶向CDK4/6信號和免疫檢查點是否會產生顯著的抗腫瘤活性仍然未得到解答。

與單獨輔助相比，新輔助治療在復發性膠質母細胞瘤的臨床影響尚不清楚。該研究未能證實新輔助帕博利珠單抗的生存優勢。與該研究團隊的初步隨機研究相比，該研究的新輔助擴展隊列的生存期顯著降低。盡管與初始新輔助隊列相比，擴展隊列中由于術后腫瘤體積增加以及高比例IDH野生型腫瘤可能影響了生存期，但這些差異尚未達到統計學顯著性。

該研究存在一些重要的局限性。它未對生存分析進行充分的樣本量估算，因此新輔助帕博利珠單抗對復發性膠質母細胞瘤患者的生存影響仍不清楚。其他局限性包括其單臂設計、缺乏同期對照隊列以及樣本量小。未來的臨床試驗應針對生存分析進行充分的樣本量估算，并評估這些生物標志物特征是否能夠預測膠質母細胞瘤對免疫檢查點抑制的反應。

參考文獻：McFaline-Figueroa, J.R., Sun, L., Youssef, G.C.et al.Neoadjuvant anti-PD1 immunotherapy for surgically accessible recurrent glioblastoma: clinical and molecular outcomes ofa stage2 single-arm expansion cohort.Nat Commun15, 10757 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-54326-7