【寫在前面】：本期推薦的是由梅州醫學科學院、梅州人民醫院等研究團隊近期發表于Journal of Ethnopharmacology(IF=4.8）的一篇文章，揭示甘草瀉心湯通過抑制ACSL4介導的鐵死亡減輕實驗性結腸炎。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Gancao Xiexin decoction attenuated experimental colitis through suppressing ACSL4-mediated ferroptosis

民族藥理學相關性：甘草瀉心湯（GCXXD），由甘草、半夏、黃芩、生姜、人參、黃連、大棗組成，是一種用于治療潰瘍性結腸炎（UC）的傳統中藥方劑。然而，GCXXD治療UC的潛在機制尚未完全闡明。

研究目的：潰瘍性結腸炎是一種以腸道屏障破壞為特征的慢性胃腸道炎癥性疾病。先前的研究表明，腸上皮細胞（IECs）中過度激活的鐵死亡會加重結腸的損傷和局部通透性異常。鐵死亡的主要機制之一是脂質過氧化物，其依賴于長鏈酰基輔酶A合成酶4（ACSL4）來合成膜磷脂。最近的研究結果表明，GCXXD通過保護腸道黏膜屏障顯著減輕了潰瘍性結腸炎（UC）的癥狀。因此，我們旨在證明GCXXD的藥理機制與ACSL4介導的鐵死亡有關。

材料與方法：在這項研究中，我們評估了GSE134025數據集，并建立了由DSS誘導的結腸炎實驗模型，用20 mg/kg的ACSL4抑制劑（羅格列酮）進行治療。通過結腸病理改變和阿爾西藍染色（用于顯示組織或細胞樣本中的酸性黏多糖 <如硫酸軟骨素、硫酸角質素等> 及其他黏液物質）來證實ACSL4抑制作為UC的潛在治療方法。隨后，我們檢查了GCXXD（9、12、15 g/kg）治療后UC小鼠的疾病癥狀、腸道黏膜修復和鐵死亡標志物。結腸組織的轉錄組研究揭示了GCXXD在治療UC方面的潛在機制。最后，我們在治療UC時聯合使用ACSL4上游激動劑和GCXXD，以證明GCXXD通過調節ACSL4誘導的鐵死亡來減少UC的炎癥。

結果：通過GSE134025數據集分析，我們發現ACSL4在UC患者中顯著表達，其抑制劑成功減輕了UC結腸的臨床癥狀。此外，我們發現GCXXD改善了結腸長度和體重，同時增加了黏蛋白（Mucin）、閉合蛋白（Occludin）和Claudin-1的表達。它還降低了結腸炎癥細胞浸潤以及IL-1β和TNF-α的水平。與此同時，GCXXD有效降低了結腸炎小鼠中與鐵死亡相關的指標，如丙二醛（MDA）、Fe2?、COX2和ACSL4，同時上調了GPX4的表達。通過對3% DSS和GCXXD治療組之間差異表達基因進行KEGG分析，我們發現了GCXXD治療與Hippo信號通路、花生四烯酸代謝之間的重要聯系。由于TEAD4作為ACSL4的上游轉錄因子，我們在治療UC時聯合使用GCXXD和YAP激動劑Py-60。值得注意的是，當激活ACSL4上游通路時，GCXXD對腸道黏膜損傷和鐵死亡的抑制作用減弱。

結論：甘草瀉心湯通過TEAD4/ACSL4通路減輕UC中的鐵死亡。

（圖文摘要）

【前言】

潰瘍性結腸炎（UC）是一種持續性的非特異性胃腸道炎癥性疾病，主要影響乙狀結腸和直腸。目前，腸道黏膜完整性受損已被認為是UC的基礎病理生理機制，也是患者中主要的難治性因素。由于UC中的持續炎癥會直接破壞上皮細胞的緊密連接結構，病原菌可以穿過受損的黏膜組織并刺激免疫細胞，從而導致腸道炎癥加劇。機體對腸道損傷的反應涉及腸上皮細胞（IECs）的丟失和再生。然而，這一機制并不能解決UC患者黏膜損傷的修復問題。根據研究，在UC中發現了異常的程序性細胞死亡，導致腸道損傷增加和局部通透性問題。

鐵死亡是一種最近被識別的程序性細胞死亡形式，它在特定病理狀態下導致激活細胞的選擇性清除，并與多種胃腸道疾病密切相關。臨床研究發現，潰瘍性結腸炎患者在腸上皮細胞中表現出鐵死亡的特征性形態，如線粒體收縮。而使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1已被發現能成功預防UC小鼠的潰瘍形成。脂質過氧化物的形成在鐵死亡的發展中起著關鍵作用，其敏感性與脂質代謝密切相關。研究表明，缺乏長鏈酰基輔酶A合成酶家族成員4（ACSL4）表達的細胞即使在GPX4被敲除的情況下也能保護自己免受鐵死亡的影響。ACSL4催化產生花生四烯酰輔酶A和腎上腺酰輔酶A，這些物質通過LPCAT3重新酯化成類似于PE的磷脂，從而增強鐵死亡的敏感性。最近的研究顯示，UC患者結腸黏膜中ACSL4表達升高，而降低ACSL4水平已被證明可以緩解癥狀并預防UC動物的鐵死亡。靶向或降低ACSL4的轉錄活性作為干擾腸道鐵死亡和恢復腸道完整性的治療方法具有潛力。

作為一種傳統中藥，甘草瀉心湯（GCXXD）多年來常被用于治療包括結腸炎在內的胃腸道疾病。根據研究，GCXXD在緩解或消除臨床癥狀、提高結腸病理改善以及展示更高的治愈率和更低的復發率方面優于美沙拉嗪。GCXXD可以通過調節免疫功能來降低UC患者中促炎因子IL-6和IL-17的水平。最近的研究表明，GCXXD通過維持腸道黏膜屏障穩態對UC具有顯著的治療效果，但其機制尚不清楚。因此，對其在治療UC中的具體作用機制進行更多研究是必要的。鑒于鐵死亡在腸道黏膜損傷中的重要性，我們推測抑制鐵死亡可能是GCXXD在UC治療中產生療效的機制之一。本研究將以ACSL4介導的鐵死亡為切入點，探討其作為UC的潛在治療靶點，并以GCXXD為例，為解決UC的黏膜愈合問題提供新的思路。

【結果】

3.1. ACSL4介導的鐵死亡參與UC發生發展

我們對比UC患者和正常組織的轉錄組數據（GEO登錄號：GSE134025）后發現，UC患者中ACSL4及其他鐵死亡關鍵基因表達上調（圖1A和B）。同時，我們用ACSL4抑制劑羅格列酮（Doll等人，2017年）干預DSS誘導的UC小鼠，發現該抑制劑可有效恢復UC小鼠的結腸長度（圖1C），緩解體重減輕（圖1D）和結腸組織潰瘍（圖1E），并增加小鼠結腸上皮細胞的黏蛋白分泌（圖1F）。這表明，靶向ACSL4介導的鐵死亡可能是治療UC的潛在策略。

3.2. GCXXD緩解DSS誘導的結腸炎小鼠的病理指標和組織損傷

既往研究表明GCXXD對UC患者有治療作用。本研究中，我們首先用液相色譜-質譜聯用法對GCXXD中的化學成分進行鑒定，發現其中含有多種主要活性成分，包括甘草素、黃芩素、人參皂苷Rg1、小檗堿、甘草苷元、氧化苦參堿、異甘草苷元和姜黃素（圖2A），補充材料（補充文件1）中有詳細數據。此外，我們采用3% DSS建立UC實驗模型，同時給予GCXXD治療。11天后，3% DSS模型組的結腸縮短程度明顯大于正常組，而GCXXD給藥改善了結腸長度（圖2B），緩解了小鼠的腸道出血和腹瀉等癥狀（圖2C），減輕了結腸炎引起的體重減輕（圖2D）。蘇木精-伊紅染色的組織學檢查顯示，3% DSS處理的小鼠結腸炎嚴重，表現為上皮脫落和多形核白細胞浸潤到結腸固有層，而GCXXD治療似乎成功改善了這些癥狀（圖2E）。

3.3腸道黏膜的慢性炎癥可直接破壞上皮緊密連接結構。本研究發現，GCXXD可降低血漿中TNF-α、IL-1β等炎癥因子含量（圖3E和F），同時上調TGF-β（圖3G），還能恢復結腸組織中閉合蛋白、緊密連接蛋白1和黏蛋白的表達（圖3A-D）。

3.4. GCXXD減少ACSL4相關的鐵死亡發生

鐵死亡的過度激活對UC的黏膜組織愈合過程有顯著的不良影響。我們的實驗結果顯示，UC小鼠血清中丙二醛（圖4F）和COX2（圖4G）等鐵死亡標志物升高，但GCXXD治療可有效降低這些標志物。此外，GCXXD減少結腸中Fe2?含量（圖4A和B），抑制ACSL4表達并恢復UC小鼠結腸中GPX4蛋白水平（圖4C-E）。

3.5.GCXXD通過可能與Hippo信號通路相關的機制減少鐵死亡

為了探討GCXXD治療UC與鐵死亡之間的聯系，我們收集了正常組、3% DSS組和高劑量GCXXD組的結腸組織進行轉錄組分析。通過KEGG分析3% DSS組和GCXXD治療組之間的差異表達基因，我們發現GCXXD治療UC與鐵死亡、花生四烯酸代謝和Hippo信號通路之間存在聯系（圖5A-C）。有趣的是，GCXXD降低了結腸中ACSL4（圖5D）和TEAD4（圖5E）mRNA的表達。隨后，我們利用GEPIA數據庫研究了這兩個基因之間的相關性，結果表明ACSL4和TEAD4之間存在正相關關系（圖5F）。此外，結腸蛋白檢測數據顯示，GCXXD減少了結腸炎動物中ACSL4上游Hippo信號通路的激活（圖5G和H）。

3.6.GCXXD通過TEAD4/ACSL4通路減少鐵死亡

在這項研究中，我們使用YAP激動劑Py-60與GCXXD聯合應用，以在UC小鼠中驗證轉錄組學研究結果。聯合使用YAP激動劑和GCXXD降低了其在UC中的治療效果，表現為結腸長度和體重的恢復有限（圖6A和B）、血清TNF-α和MPO水平降低（圖6D和E）以及組織學指標改善（圖6C）。此外，激活Hippo信號通路，如活性YAP1進入細胞核或TEAD4表達升高（圖7A和B），限制了GCXXD對鐵死亡的抑制作用。聯合治療組并未降低結腸組織中的Fe2?（圖6F）和ACSL4水平，也未提高GPX4表達（圖7C-E）。這些數據表明，GCXXD通過TEAD4/ACSL4通路抑制鐵死亡。

潰瘍性結腸炎是一種慢性、易復發的腸道炎癥性疾病，其特征是持續的炎癥、廣泛的潰瘍和結腸黏膜的破壞。根據流行病學研究，大約三分之一的重度UC患者會出現原發性硬化性膽管炎、壞死性皮炎、靜脈血栓等并發癥。由于其“炎癥”特性，UC的研究大多集中在免疫治療策略上，如抗TNF-α抗體等生物制劑的開發。盡管這些藥物在短時間內改變了UC的治療格局，但仍有一小部分患者對現有治療反應不佳。因此，了解UC的病理生理學并開發更有效的治療方法仍然是一個重要的科學問題。

UC發病早期以腸道屏障破壞和黏膜穩態喪失為特征。臨床研究表明，成功的腸道黏膜修復有助于癥狀改善、降低手術風險，并且是UC患者藥物治療的重要預后指標。腸道黏膜由四種上皮細胞組成：柱狀細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和神經內分泌細胞。柱狀細胞構成腸道上皮的絕大部分，其腔面有微小指狀突起，稱為微絨毛，被糖萼層包圍。這種黏液單層起到物理屏障的作用，防止腔內致病菌進入腸道黏膜。一旦腸道屏障的完整性受損，大量腸道細菌會穿過腸道上皮屏障，導致免疫系統過度激活和異常的免疫及炎癥反應。因此，這會破壞腸道黏膜免疫微環境的穩態，最終促進潰瘍性結腸炎的發展。因此，修復受損的腸道黏膜已被公認為UC治療的關鍵。

甘草瀉心湯（GCXXD）是一種中藥方劑，對UC的黏膜損傷具有預防作用。然而，其確切機制尚不清楚。GCXXD由甘草、半夏、黃芩、生姜、人參、黃連、大棗組成。這些植物名稱已在藥用植物名稱服務（MPNS）（http://mpns.kew.org）中得到驗證。在這項研究中，我們使用高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）鑒定了GCXXD中的典型物質，如甘草素、黃芩素、人參皂苷Rg1、小檗堿、氧化苦參堿和姜黃素。然后我們建立了DSS誘導的UC模型，以評估GCXXD對UC小鼠的治療效果。結果表明，GCXXD不僅改善了UC癥狀，如體重減輕、結腸縮短和組織潰瘍，還恢復了緊密連接蛋白Occludin、Claudin 1和Mucin的表達。這些表明GCXXD對腸道損傷具有很強的修復作用。值得注意的是，腸道上皮細胞的更新速度是最快的，有助于腸道損傷的愈合。同時，調節性T細胞（Treg）、固有淋巴樣細胞（ILCs）和巨噬細胞衍生的細胞因子，如IL-10、IL-22和TGF-β，可以促進腸道上皮細胞的黏液分泌和RegIIIβ、RegIIIγ抗菌肽的表達，并誘導腸道干細胞的增殖，通過信號傳導增強屏障修復。盡管如此，黏膜修復在UC中仍然是一個問題，可能是因為上皮損傷未能成功緩解或預防，從而加劇了腸上皮細胞（IEC）的脫落。

臨床研究表明，錯誤或過量補充鐵可能會增加UC惡化的風險。通常認為鐵可以通過芬頓反應導致活性氧（ROS）積累，從而引發脂質過氧化。脂質過氧化物的分解會產生4-羥基壬烯酸和丙二醛，這可能導致細胞膜中蛋白質和核酸的異常共價改變，從而激活細胞的鐵死亡機制。此外，研究人員發現，經歷鐵死亡的IEC會產生如HMGB1等損傷相關分子模式，這會顯著激活先天免疫系統，增加IEC脫落和腸道高通透性。抑制鐵死亡可能有助于UC動物腸道黏膜完整性的恢復，這表明過度的鐵死亡激活可能是腸道損傷修復的重要障礙。在這項研究中，我們發現GCXXD可以成功降低UC小鼠中鐵死亡標志物如Fe2?、COX2和MDA的含量。此外，轉錄組分析結果也證明了GCXXD治療UC與鐵死亡有關。因此，我們希望繼續研究GCXXD抑制鐵死亡的可能機制。

谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）途徑是調節鐵死亡的公認機制。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的作用是將磷脂鏈產生的脂質過氧化物還原為脂質醇，從而降低腸道上皮細胞對鐵死亡的敏感性。研究表明，上調GPX4表達可以改善UC小鼠的結腸組織學損傷。脂質過氧化被認為是脂質代謝中的特異性過程，細胞脂質和脂質代謝在鐵死亡的調節中起著關鍵作用。作為鐵死亡的信號脂質，PE-AA和PE-AdA的合成從脂肪酸酰基化開始。長鏈酰基輔酶A合成酶家族成員4（ACSL4）將輔酶A連接到多不飽和脂肪酸（PUFA）如花生四烯酸（AA）及其衍生物腺苷二磷酸（AdA），然后在溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3（LPCAT3）的催化下與膜磷脂結合。PE過氧化產生的脂質自由基，包括磷脂過氧化自由基（PLOO?），引發脂質過氧化鏈反應，最終導致鐵死亡。ACSL4已被確定為鐵死亡的關鍵基因，ACSL4介導的脂質代謝已成為鐵死亡的重要靶點。在回顧GSE134025的數據集后，我們發現ACSL4在UC患者的黏膜中表達顯著，ACSL4抑制劑在UC動物中有效。這表明，靶向ACSL4介導的鐵死亡可能是治療UC的一種可行方法。

蛋白質分析結果顯示，GCXXD可能會顯著抑制結腸中ACSL4的表達。最近的研究發現，ACSL4產生的膜脂質可以抑制GPX4的表達，促進腎細胞的鐵死亡。而GCXXD對GPX4的表達有有益影響。進一步研究GCXXD和3%DSS組之間的差異基因表達表明，GCXXD治療UC可能包括激活Hippo信號系統。由于沒有ACSL4激動劑，而TEAD4是ACSL4的上游轉錄因子，我們使用YAP激動劑Py-60與GCXXD聯合治療UC小鼠。有趣的是，通過激活Hippo通路增加ACSL4表達時，GCXXD的治療效果及其對UC的鐵死亡抑制作用被削弱。盡管本研究的結果已經表明GCXXD通過抑制ACSL4介導的鐵死亡有效治療UC，但需要考慮潛在的藥物脫靶效應。因此，目前正在進行更嚴格的實驗，例如通過重組腺相關病毒將ACSL4/TEAD4基因遞送到腸道上皮細胞中。

【結論】

目前的研究已經證明，GCXXD通過抑制ACSL4介導的鐵死亡來治療潰瘍性結腸炎，恢復腸道上皮細胞的正常脫落和再生，并促進腸道黏膜屏障的自我修復（圖8）。

注：本文原創表明為原創編譯，非聲張版權，侵刪！

中醫藥科研及交流入群，加微信：

【福利時刻】科研服務（點擊查看）：、、、、、。