近日，中國獸藥監(jiān)察所鄒興啟副研究員聯(lián)合南京農(nóng)業(yè)大學鄭龍三教授與錢鶯娟教授成果以“ASFV pS183L protein negatively regulates RLR-mediated antiviral signalling by blocking MDA5 oligomerisation（ASFV pS183L 蛋白通過阻斷 MDA5 寡聚化負向調(diào)節(jié) RLR 介導(dǎo)的抗病毒信號傳導(dǎo)）”為題在 Veterinary Research（Q1 IF:3.7） 發(fā)表。

在病毒與宿主的這場無硝煙戰(zhàn)爭中，每一次新的發(fā)現(xiàn)都可能成為改寫戰(zhàn)局的關(guān)鍵。近期，一項關(guān)于非洲豬瘟病毒（ASFV）的研究成果引起了科學界的廣泛關(guān)注。研究表明，ASFV 的 pS183L 蛋白在抑制宿主抗病毒信號通路中扮演著極為重要的角色，尤其是在阻斷 RLR 介導(dǎo)的抗病毒信號傳導(dǎo)方面，其機制之精巧，讓人驚嘆。

非洲豬瘟，這個養(yǎng)豬業(yè)的 “頭號殺手”，自出現(xiàn)以來就給全球養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的沖擊。由于目前缺乏有效的商業(yè)疫苗，其防控難度極大。深入了解 ASFV 的致病機制和免疫逃逸策略，成為了攻克這一難題的關(guān)鍵。而此次關(guān)于 pS183L 蛋白的研究，無疑為我們揭開了 ASFV 神秘面紗的一角。

我們先來了解一下 RLR 介導(dǎo)的抗病毒信號通路。這是宿主免疫系統(tǒng)抵御病毒入侵的一道重要防線。當病毒入侵細胞時，細胞內(nèi)的模式識別受體 RLR 能夠識別病毒的核酸，進而激活一系列的信號傳導(dǎo)，最終誘導(dǎo)干擾素等抗病毒因子的產(chǎn)生，啟動宿主的抗病毒免疫反應(yīng)。然而，ASFV 的 pS183L 蛋白卻如同一個狡猾的 “破壞者”，精準地找到了這一防線的薄弱點。

研究人員發(fā)現(xiàn)，pS183L 蛋白能夠特異性地阻斷 MDA5 的寡聚化過程。MDA5 作為 RLR 家族的重要成員，其寡聚化是激活下游信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵步驟。就好比 MDA5 是一把鑰匙，只有當它 “組裝” 成正確的形狀（寡聚化），才能打開激活抗病毒信號通路的 “大門”。而 pS183L 蛋白的出現(xiàn)，就像是在鑰匙孔里塞了一把錯誤的 “異物”，讓 MDA5 無法正常寡聚化，從而阻斷了整個抗病毒信號的傳遞。

為了證實這一發(fā)現(xiàn)，科研團隊進行了一系列嚴謹?shù)膶嶒灐Ｔ诩毎麑嶒炛校麄冇^察到，當細胞感染了攜帶 pS183L 蛋白的 ASFV 病毒后，MDA5 的寡聚化水平明顯降低，下游的抗病毒信號分子的激活也受到了顯著抑制。進一步的分子生物學實驗表明，pS183L 蛋白與 MDA5 之間存在直接的相互作用，這種相互作用改變了 MDA5 的空間構(gòu)象，使其無法正常聚集形成寡聚體。

這一研究成果的意義不僅僅在于揭示了 ASFV 的一種新的免疫逃逸機制，更重要的是，它為開發(fā)針對非洲豬瘟的新型防控策略提供了潛在的靶點。如果我們能夠找到一種方法，干擾 pS183L 蛋白與 MDA5 的相互作用，或者阻斷 pS183L 蛋白的功能，那么就有可能重新激活宿主的抗病毒免疫反應(yīng)，為非洲豬瘟的防控帶來新的希望。

目前，相關(guān)的研究仍在緊鑼密鼓地進行中。科研人員正在進一步探索 pS183L 蛋白的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，希望能夠設(shè)計出更加精準有效的干預(yù)手段。同時，這一發(fā)現(xiàn)也為我們理解其他病毒與宿主之間的相互作用提供了新的思路和參考。

在這場與病毒的賽跑中，每一次新的突破都來之不易。讓我們共同期待，隨著研究的不斷深入，能夠早日找到戰(zhàn)勝ASFV有效方法，為全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展保駕護航。

Introduction

非洲豬瘟（ASF）由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起，是一種影響家豬和野豬的急性出血性疾病。自 1921 年在肯尼亞被確認以來，非洲豬瘟已蔓延至非洲、歐洲和亞洲。高致死性的基因 II 型 ASFV 毒株于 2018 年 8 月在中國沈陽首次被報道。從那以后，它幾乎傳播到了中國的所有省份，造成了巨大的經(jīng)濟損失。隨后的監(jiān)測研究表明，由于高毒力 ASFV 毒株基因組的自然突變，中國出現(xiàn)了低毒力的基因 II 型毒株。2021 年，在中國鑒定出了與 NH/P68 和 OURT88/3 相似的基因 I 型毒株。這些毒株比基因 II 型毒株表現(xiàn)出更低的毒力、更長的潛伏期和更強的傳播能力，給疾病防控帶來了新的挑戰(zhàn)。更令人擔憂的是，在 2021 年和 2022 年，中國發(fā)現(xiàn)了高致死性的基因 I 型和 II 型 ASFV 重組毒株。

ASFV 是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，是一種雙鏈 DNA 病毒。其基因組大小在 170 到 190 千堿基對之間，編碼 150 到 200 種病毒蛋白，其中包括 50 多種結(jié)構(gòu)蛋白和 100 多種非結(jié)構(gòu)蛋白。ASFV 基因組編碼的蛋白質(zhì)參與病毒的復(fù)制、病毒粒子組裝、二十面體形成、免疫逃逸等過程。例如，B 型 DNA 聚合酶（pG1211R）、II 型 DNA 拓撲異構(gòu)酶（pP1192R）、DNA 連接酶（pNP419L）、DNA 引發(fā)酶（pC962R）以及類組蛋白 DNA 結(jié)合蛋白（pA104R）已被證明可以獨立于宿主細胞參與 ASFV 的復(fù)制。據(jù)報道，非結(jié)構(gòu)蛋白 B602L 和跨膜蛋白 p17 參與病毒粒子組裝或二十面體的形成。

此外，不同的 ASFV 蛋白采用了多樣的免疫逃逸策略。例如，據(jù)報道 pMGF505-7R、pMGF505-11R、pH240R 和 pE184L 通過靶向 STING 蛋白抑制由 cGAS-STING 通路介導(dǎo)的 IFN-β 的產(chǎn)生。研究表明，pI267L 會損害由 RNA 聚合酶 III-RIG-I（視黃酸誘導(dǎo)基因 I）激活的先天性抗病毒反應(yīng)。另外，pMGF505-7R 和 pH240 通過靶向 NLRP3 炎癥小體通路抑制白細胞介素 - 1β（IL-1β）的產(chǎn)生。盡管如此，近一半的病毒蛋白功能仍然未知，包括免疫調(diào)節(jié)蛋白，這給開發(fā)有效的疫苗和抗病毒藥物帶來了挑戰(zhàn)。

I 型干擾素（IFN-I）反應(yīng)是宿主在病毒感染時的首要防御機制。它由模式識別受體（PRRs）識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）所觸發(fā)。模式識別受體是一類受體，包括視黃酸誘導(dǎo)基因 I 樣受體（RLRs）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD 樣）受體（NLRs）、Toll 樣受體（TLRs）和環(huán)化 GMP-AMP 合成酶（cGAS）。

最近，在病毒感染過程中，尤其是在單純皰疹病毒 1 型（HSV-1）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒 1 型（KSHV-1）、ASFV 和偽狂犬病病毒（PRV）等 DNA 病毒感染時，對細胞質(zhì) DNA 傳感器 cGAS 進行了專門研究。有趣的是，有報道稱 RLR 信號通路也會被 DNA 病毒感染所激活。例如，單純皰疹病毒 1 型（HSV-1）感染主要由黑色素瘤分化相關(guān)蛋白 5（MDA5）識別，從而激活 IFN-β 的產(chǎn)生。也有報道稱，愛潑斯坦 - 巴爾病毒（EBV）編碼的小 RNA 可被 RIG-I 識別，并在 EBV 感染的細胞中激活 I 型干擾素信號通路。此外，最近的一份報告顯示，在 HSV-1 感染時，宿主來源的 RNA 會激活 RIG-I 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。同樣，宿主來源的 RNA 會激活 RLRs，以限制卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）的裂解性再激活。另一項研究證實，在 ASFV 感染時，RIG-I 和 MDA5 的 mRNA 水平會上調(diào)。ASFV 糖蛋白 I329L 也已被證明可以抑制雙鏈 RNA（dsRNA）刺激下的 NF-κB 和干擾素調(diào)節(jié)因子 3（IRF3）的激活。然而，ASFV 感染激活 RLR 信號通路的機制以及調(diào)節(jié) RLR 通路的特定 ASFV 蛋白在很大程度上仍不為人知。

RIG-I 和 MDA5 屬于識別 RNA 的細胞質(zhì)病毒受體 RLR 家族，它們結(jié)構(gòu)相似，并且具有相同的信號銜接蛋白 —— 線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）。RIG-I 識別帶有 5'-ppp 帽的短雙鏈 RNA，而 MDA5 識別更長的雙鏈 RNA（dsRNA）的內(nèi)部雙鏈結(jié)構(gòu)。當與雙鏈 RNA 結(jié)合時，RIG-I/MDA5 會發(fā)生構(gòu)象重排，誘導(dǎo) RIG-I 或 MDA5 寡聚體的形成。隨后，RIG-I 或 MDA5 寡聚體轉(zhuǎn)移到線粒體并招募 MAVS，這會刺激 TANK 結(jié)合激酶 1（TBK1）和 IκB 激酶（IKK）的磷酸化。磷酸化的 TBK1 和 IKK 隨后激活 IRF3 或 NF-κB 向細胞核的轉(zhuǎn)位，從而啟動干擾素的轉(zhuǎn)錄。

作者的研究發(fā)現(xiàn)，pS183L 通過蛋白質(zhì)間的相互作用抑制 MDA5 的寡聚化，從而對 RLR 介導(dǎo)的抗病毒信號產(chǎn)生負面影響。重要的是，pS183L 是一種此前未被深入研究過的 ASFV 蛋白。探索未被充分了解的 ASFV 蛋白在調(diào)節(jié)宿主 IFN 反應(yīng)中的作用，將豐富人們對病毒感染的認識，并為疫苗開發(fā)提供新的靶點。

Result

非洲豬瘟病毒 pS183L 蛋白減弱 MDA5 介導(dǎo)的 IFN-β 激活

眾所周知，作為一種大型雙鏈 DNA 病毒，非洲豬瘟病毒（ASFV）的感染會激活 cGAS-STING 信號通路，進而誘導(dǎo) I 型干擾素反應(yīng)。此外，有報告指出，在 ASFV 感染的早期階段，視黃酸誘導(dǎo)基因 I（RIG-I）和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白 5（MDA5）的轉(zhuǎn)錄被激活，但在后期階段則受到抑制。最近，有研究報道稱，從轉(zhuǎn)染了富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的 ASFV 基因組（ASFV-AT）的 PK15 細胞中提取的 RNA 能夠激活 IFN-β 啟動子。有趣的是，由 ASFV-AT 刺激產(chǎn)生的 IFN-β 可以被 RNA 聚合酶 III（RNA Pol-III）的特異性抑制劑（ML-60218）下調(diào)，這表明富含 ASFV-AT 的基因組能夠激活由 RNA Pol-III-RIG-I 介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。然而，調(diào)節(jié) MDA5 介導(dǎo)通路的 ASFV 蛋白仍然未知。

作者使用雙熒光素酶報告基因檢測法篩選了幾種 ASFV 編碼的蛋白，以確定哪些 ASFV 蛋白能夠調(diào)節(jié) MDA5 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。為此，將每種病毒蛋白與 IFN-β 熒光素酶報告基因以及 MDA5 刺激物一起轉(zhuǎn)染。在這些蛋白中，鑒定出了 pS183L 蛋白（補充文件 1）。為了證實這一結(jié)果，在 293T 細胞和 PK15 細胞中，將 pGL3-Basic-IFN-β-Luc、pCMV-RL 與 MDA5/RIG-I/cGAS-STING 和 / 或 S183L 表達載體共轉(zhuǎn)染，進行雙熒光素酶報告基因檢測。結(jié)果顯示，pS183L 減弱了 MDA5 介導(dǎo)的 IFN-β 啟動子活性（圖 1A 和 D），但對 RIG-I 介導(dǎo)的（圖 1B 和 E）或 cGAS-STING 介導(dǎo)的 IFN-β 啟動子活性沒有影響（圖 1C 和 F）。因此，這些結(jié)果表明，pS183L 可能抑制 MDA5 介導(dǎo)的 IFN-β 信號通路。

非洲豬瘟病毒 pS183L 蛋白抑制雙鏈 RNA（dsRNA）觸發(fā)的 IFN-β 產(chǎn)生

RIG-I 識別短的合成雙鏈 RNA（<0.5 千堿基對），而 MDA5 識別長的雙鏈 RNA（0.5–7 千堿基對）。因此，高分子量（HMW）的聚肌胞苷酸（poly (I:C)，1.5–8 千堿基對），這種雙鏈 RNA 的合成類似物，只會被 MDA5 識別，而 RIG-I 主要識別低分子量（LMW）的 poly (I:C)（0.2–1 千堿基對）。為了證實 pS183L 對 MDA5 介導(dǎo)的 IFN-β 產(chǎn)生的抑制作用，在 PK15 細胞中轉(zhuǎn)染 S183L 或空載體后，使用低分子量和高分子量的 poly (I:C) 來激活 RIG-I 或 MDA5。然后通過實時熒光定量 PCR（RT-qPCR）檢測 IFN-β 的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，無論是否用 poly (I:C) 處理，pS183L 的過表達都會降低 IFN-β mRNA 的水平，在用高分子量 poly (I:C) 處理時尤其明顯（圖 2A）。隨著 pS183L 表達量的增加，IFN-β mRNA 的水平持續(xù)下降（圖 2B 和 C）。

圖2：pS183L抑制IFN-β、TNF-α和ISG54 mRNA的表達水平。

當細胞內(nèi)存在 pS183L 時，腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）和干擾素刺激基因 54（ISG54）的 mRNA 水平均下降（圖 2D 和 E）。有趣的是，pS183L 對由低分子量和高分子量 poly (I:C) 激活的信號級聯(lián)反應(yīng)都有雙重抑制作用。因此，作者研究了 RIG-I 和 MDA5 在低分子量和高分子量 poly (I:C) 刺激下的表達水平。

研究結(jié)果表明，低分子量和高分子量的 poly (I:C) 均能誘導(dǎo) MDA5 mRNA 和蛋白表達上調(diào)（補充文件 2）。正如先前的研究報道，這種上調(diào)在間充質(zhì)干細胞（MSCs）中也有觀察到。這一結(jié)果也可以解釋為什么 pS183L 在抑制低分子量和高分子量 poly (I:C) 刺激的信號傳導(dǎo)的同時，會特異性地下調(diào)由 MDA5 刺激誘導(dǎo)的 IFNβ 熒光素酶報告基因活性。此外，pS183L 也可能靶向 RIG-I，這可能會影響其對 RNA 的識別或涉及其他需要進一步研究的機制。總之，這些結(jié)果表明，pS183L 通過靶向 MDA5 介導(dǎo)的通路來調(diào)節(jié) RLR 信號傳導(dǎo)。

非洲豬瘟病毒 pS183L 蛋白抑制 MDA5 與線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）之間的 RLR 信號傳導(dǎo)

病毒雙鏈 RNA 與 RLR 家族受體結(jié)合會誘導(dǎo) RIG-I 或 MDA5 發(fā)生構(gòu)象變化和寡聚化，進而激活線粒體蛋白 MAVS 和細胞質(zhì)激酶 TANK 結(jié)合激酶 1（TBK1），以刺激 IFN-β 信號傳導(dǎo)。本研究使用信號級聯(lián)反應(yīng)中的不同因子來激活 RLR 信號通路，以確定 pS183L 的具體作用靶點，即 RIG-I、MDA5、MAVS 和 TBK1。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，pS183L 減弱了由 MDA5 激活的 IFN-β 啟動子活性，但對由 RIG-I、MAVS 或 TBK1 激活的 IFN-β 啟動子活性沒有影響。這一發(fā)現(xiàn)在 PK15 細胞（圖 3A）和 293T 細胞（圖 3B）中均有觀察到。因此，在 PK15 細胞中，用不同劑量的 S183L 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，并在 RIG-I、MDA5 或 MAVS 刺激后，進一步確認這一結(jié)果。

圖3:pS183L在MDA5及下游、MAVS上游抑制IFN-β激活

研究結(jié)果顯示，pS183L 以劑量依賴的方式持續(xù)抑制 MDA5 介導(dǎo)的 IFN-β 啟動子激活（圖 3C），但對 RIG-I（圖 3D）或 MAVS（圖 3E）介導(dǎo)的 IFN-β 啟動子激活沒有抑制作用。這些結(jié)果表明，pS183L 在 MDA5 及下游、MAVS 上游抑制 IFN-β 的信號傳導(dǎo)。免疫印跡結(jié)果顯示，在 PK15 細胞中，當 pS183L 過表達時，poly (I:C) 刺激產(chǎn)生的磷酸化 TBK1（p-TBK1）、磷酸化 IRF3（p-IRF3）和磷酸化 IκBα（p-IκBα）水平降低，尤其是在用高分子量 poly (I:C) 處理時（圖 3F）。用低分子量 poly (I:C) 或高分子量 poly (I:C) 刺激不同時間的結(jié)果表明，pS183L 對 RLR 信號通路的抑制作用具有時間依賴性（圖 3G）。一般來說，pS183L 過表達后 p-TBK1 水平的下調(diào)表明，pS183L 的作用靶點位于 TBK1 的上游，這與雙熒光素酶檢測的結(jié)果一致（圖 3A–E）。

綜上所述，這些結(jié)果表明，pS183L 在 MDA5 及下游、MAVS 上游抑制 MDA5 介導(dǎo)的 IFN-β 信號傳導(dǎo)。

非洲豬瘟病毒 pS183L 蛋白與 MDA5 相互作用

RNA 傳感器 MDA5 在檢測到病毒 RNA 后會招募 MAVS，從而啟動 I 型干擾素信號傳導(dǎo)。考慮到 pS183L 在 MDA5 及下游、MAVS 上游抑制 IFN-β 的產(chǎn)生，作者假設(shè) pS183L 的作用靶點是 MDA5。因此，進行了免疫共沉淀實驗，通過在 293T 細胞中共轉(zhuǎn)染表達 MDA5 和 S183L 的質(zhì)粒，來分析 pS183L 與 MDA5 之間的蛋白質(zhì)相互作用。

實驗結(jié)果顯示，在使用 Flag 抗體免疫沉淀的 MDA5 蛋白復(fù)合物中檢測到了帶有 HA 標簽的 S183L（圖 4A）。相反，在使用 Flag 抗體免疫沉淀的 pS183L 蛋白復(fù)合物中檢測到了帶有 HA 標簽的 MDA5（圖 4B）。然而，在使用 MAVS 免疫沉淀的復(fù)合物中未檢測到 pS183L（圖 4C），并且在 pS183L 免疫沉淀的復(fù)合物中也沒有 MAVS（圖 4D）。隨后，在 ASFV 感染的豬肺泡巨噬細胞（PAM）中進行免疫共沉淀實驗，以驗證 pS183L 與 MDA5 之間的相互作用。免疫共沉淀實驗的結(jié)果表明，內(nèi)源性 MDA5 存在于 pS183L 抗體免疫沉淀的復(fù)合物中（圖 4E）。

圖4：pS183L與MDA5的半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（CARD）以及解旋酶結(jié)構(gòu)域相互作用。

此外，間接免疫熒光實驗表明，在 293T 細胞中，pS183L 在細胞質(zhì)和細胞核中均有定位，而 pS183L 與 MDA5 在細胞質(zhì)中共定位（圖 4F）。由于 pS183L 是一種未被充分研究的蛋白，除了免疫逃逸之外，它在 ASFV 感染過程中可能在細胞核中也發(fā)揮著一定作用。MDA5 由兩個半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（CARD）、一個中央解旋酶結(jié)構(gòu)域和一個 C 端結(jié)構(gòu)域（CTD）組成。據(jù)報道，MDA5 的 CARD 結(jié)構(gòu)域與 MAVS 相互作用并激活下游信號傳導(dǎo)。解旋酶結(jié)構(gòu)域負責依賴 RNA 的 ATP 水解，而 CTD 結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合雙鏈 RNA。

構(gòu)建了帶有 Flag 標簽的 MDA5 截斷體，包含 CARD、解旋酶或 CTD 結(jié)構(gòu)域（圖 4G），并進行免疫共沉淀實驗，以分析 MDA5 的哪個結(jié)構(gòu)域與 pS183L 相互作用。免疫共沉淀結(jié)果表明，在用 Flag 抗體沉淀的 MDA5 的 CARD 和解旋酶結(jié)構(gòu)域中鑒定出了帶有 HA 標簽的 S183L（圖 4H）。先前的報道表明，在未感染的細胞中，MDA5 的 CARD 結(jié)構(gòu)域會發(fā)生磷酸化，而在病毒感染或雙鏈 RNA 刺激下，會被蛋白磷酸酶 1α（PP1α）和蛋白磷酸酶 1γ（PP1γ）去磷酸化，會導(dǎo)致串聯(lián)CARD結(jié)構(gòu)域內(nèi)結(jié)構(gòu)變化。

值得注意的是，MDA5 的 CARD 結(jié)構(gòu)域與 K63 連接的多聚泛素鏈結(jié)合，從而激活免疫反應(yīng)。此外，有報道稱 MDA5 的 CARD 結(jié)構(gòu)域與 MAVS 的 CARD 結(jié)構(gòu)域相互作用，這表明 pS183L 可能靶向 MDA5 的 CARD 結(jié)構(gòu)域，從而破壞 MDA5 與 MAVS 之間的相互作用，進一步抑制 IFN-β 的產(chǎn)生。

pS183L 抑制 MDA5 寡聚化

作者進行了免疫共沉淀實驗，以研究 pS183L 在 MDA5 與線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）相互作用中所起的作用。結(jié)果表明，在沉淀的帶有 Flag 標簽的 MDA5 蛋白復(fù)合物中，當 S183L 過表達時，帶有 HA 標簽的 MAVS 含量減少（圖 5A）。此外，隨著 pS183L 劑量的增加，帶有 HA 標簽的 MAVS 逐漸減少（圖 5B）。一旦 MDA5 在細胞質(zhì)中被病毒 RNA 激活，它就會與未錨定的賴氨酸 - 63（K63）多聚泛素鏈結(jié)合，并啟動 MDA5 的寡聚化過程，以招募信號銜接蛋白 MAVS。因此，探究 pS183L 如何調(diào)節(jié) MDA5 從而干擾對MAVS招募是有意義。

圖5：pS183L阻斷MDA5寡聚化。

在 293T 細胞中，通過共轉(zhuǎn)染帶有 Flag 標簽的 MDA5 和泛素（UB），同時設(shè)置有或無 pS183L 表達的情況，來測定 MDA5 的 K63 多聚泛素化水平。研究結(jié)果顯示，pS183L 的表達并不影響 MDA5 的 K63 多聚泛素化水平（圖 5C）。為了進一步評估 pS183L 是否調(diào)節(jié) MDA5 的寡聚化，進行了免疫共沉淀實驗和半變性去污劑瓊脂糖凝膠電泳（SDD-AGE）實驗。結(jié)果表明，pS183L 破壞了帶有 Flag 標簽的 MDA5 和帶有 HA 標簽的 MDA5 之間的相互作用（圖 5D），以及 MDA5 的寡聚化水平（圖 5F）。此外，隨著 pS183L 劑量的增加，帶有 Flag 標簽的 MDA5 和帶有 HA 標簽的 MDA5 之間的相互作用以及 MDA5 的寡聚化水平逐漸受到抑制（圖 5E–G）。

這些數(shù)據(jù)表明，非洲豬瘟病毒（ASFV）的 pS183L 蛋白通過與 MDA5 相互作用，隨后阻斷 MDA5 的寡聚化以及對 MAVS 的招募，從而減弱了 IFN-β 的產(chǎn)生。

Dissusion

盡管非洲豬瘟（ASF）在一個世紀前就有報道，但至今仍沒有安全有效的疫苗。非洲豬瘟病毒（ASFV）具有龐大的基因組和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。它編碼超過 150 種蛋白質(zhì)，其中大多數(shù)通過不同的機制調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，如細胞凋亡、自噬、炎癥反應(yīng)和 I 型干擾素調(diào)節(jié)等。然而，許多病毒免疫調(diào)節(jié)蛋白的功能仍然未知。本研究發(fā)現(xiàn)，pS183L，一種此前未被充分了解的 ASFV 病毒蛋白，通過靶向 MDA5 來負向調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)。重要的是，據(jù)作者所知，是首次有證據(jù)表明 ASFV 蛋白能夠調(diào)節(jié)MDA5介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生。

作為一種 DNA 病毒，ASFV 與細胞質(zhì)中感知 DNA 的 cGAS-STING 信號通路之間的相互作用已被廣泛研究。這些研究結(jié)果表明，至少有 20 種 ASFV 編碼的蛋白通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（包括 STING、TBK1、IRF3 等）的寡聚化、磷酸化、泛素化或降解來抑制 cGAS-STING 信號通路。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，在 ASFV 感染的早期階段，RNA 傳感器 RIG-I 和 MDA5 的 mRNA 水平會升高，但隨著病毒復(fù)制的進行而降低。這一結(jié)果表明，ASFV 感染過程中產(chǎn)生的 RNA 中間產(chǎn)物可能與 RIG-I 和 MDA5 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)相互作用。實際上，已有研究表明 ASFV 的 I267L 蛋白會抑制由 RNA 聚合酶 III-RIG-I 介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。

盡管如此，目前還沒有關(guān)于 ASFV 編碼的蛋白調(diào)節(jié) MDA5 介導(dǎo)的免疫信號傳導(dǎo)的報道。然而，已有研究證明雙鏈 DNA 病毒單純皰疹病毒 1 型（HSV-1）的 US11 蛋白會與 MDA5 結(jié)合，破壞 MDA5-MAVS 復(fù)合物，并抑制 I 型干擾素的產(chǎn)生。作者發(fā)現(xiàn)，pS183L 不僅抑制 MDA5 介導(dǎo)的 IFN-β 啟動子的激活，還會下調(diào) PK15 細胞中由聚肌胞苷酸（poly (I:C)）誘導(dǎo)的 IFN-β 轉(zhuǎn)錄（圖 1D 和圖 2A）。因此，作者假設(shè) pS183L 是 RLR 介導(dǎo)的抗病毒信號傳導(dǎo)的潛在抑制劑。

MDA5 是一種關(guān)鍵的細胞質(zhì)雙鏈 RNA 受體，對于傳遞危險信號以啟動 IFN-β 的產(chǎn)生至關(guān)重要。在本研究中，作者證明了 pS183L 與 MDA5 的半胱天冬酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（CARD 結(jié)構(gòu)域）相互作用（圖 4A、B 和 G），但不與 MAVS 的 CARD 結(jié)構(gòu)域相互作用（圖 4C 和 D）。這一發(fā)現(xiàn)表明，pS183L 的 CARD 結(jié)構(gòu)域與 MDA5 的 CARD 結(jié)構(gòu)域有 19% 的相似性。研究結(jié)果還顯示，pS183L 與 RIG-I 相互作用（補充文件 3），這表明 pS183L 與 RIG-I 之間可能存在未知的相互作用機制。

一旦 MDA5 識別出病毒 RNA，它就會發(fā)生構(gòu)象變化，暴露并使其 CARD 結(jié)構(gòu)域多聚化，從而與 MAVS 的 CARD 結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用。因此，作者探究了 pS183L 在 MDA5 寡聚化過程中的作用。結(jié)果表明，pS183L 與 MDA5 的相互作用抑制了 MDA5 的寡聚化，進一步阻斷了 MDA5 與 MAVS 之間的相互作用（圖 5）。有趣的是，除了與 MDA5 的 CARD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合外，pS183L 還與 MDA5 的解旋酶結(jié)構(gòu)域相互作用。一般來說，MDA5 通過其解旋酶結(jié)構(gòu)域感知病毒 RNA，并通過 CARD 結(jié)構(gòu)域向下游傳遞信號。因此，pS183L 與 MDA5 解旋酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用可能會破壞病毒 RNA 的感知機制，并進一步阻斷 MDA5 信號的激活。

研究表明，RIG-I 和 MDA5 是病毒來源的病毒 RNA（尤其是甲型流感病毒、登革熱病毒和寨卡病毒等 RNA 病毒）的主要傳感器。有趣的是，在病毒感染時，宿主來源的 RNA 也會激活 RLR 信號通路。例如，HSV-1 感染會導(dǎo)致細胞非編碼 RNA 的定位錯誤和暴露，這些 RNA 會與 RIG-I 相互作用并激活 RIG-I。同樣，在卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）感染時，宿主 RNA 會被 RLR 識別，從而激活免疫反應(yīng)。在 ASFV 感染時，RIG-I 和 MDA5 都會被激活，但其機制仍不清楚。最近，有研究報道，干擾素刺激基因效應(yīng)因子 OAS1（2′, 5′- 寡腺苷酸合成酶基因 1）在 ASFV 感染后 24 小時會上調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)，OAS1 會通過調(diào)節(jié)核糖核酸酶 L（RNase L）對細胞 RNA 的切割來激活 RIG-I 和 MDA5 信號通路。然而，在 ASFV 感染的早期階段 RIG-I 和 MDA5 是如何被刺激的，以及在后期階段又是如何被下調(diào)的，目前仍不清楚。因此，在 ASFV 感染時，其他參與 RIG-I 或 MDA5 信號傳導(dǎo)的宿主或病毒因子值得進一步探索。

疫苗是預(yù)防和控制 ASFV 感染的最有效方法，但由于對許多毒力基因、病毒復(fù)制必需的關(guān)鍵基因以及調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因缺乏了解，疫苗的研發(fā)受到了阻礙。在作者之前的研究中，發(fā)現(xiàn) pI73R 和 pCP312R 被確定為 Z-DNA 結(jié)合蛋白或單鏈 DNA 結(jié)合蛋白。此外，有報道稱 I73R 是一個與毒力相關(guān)的基因，I73R 基因的缺失能為豬提供完全的同源保護。重要的是，作者還發(fā)現(xiàn)，由一個病毒復(fù)制必需基因編碼的病毒核酸外切酶 pD345L，可以通過阻斷 IKK 激酶活性來抑制 NF-κB 信號通路。

此外，一些病毒復(fù)制必需基因，如 E301R 和 S273R，據(jù)報道會通過靶向 IRF3 或 IKK 復(fù)合物來抑制 IFN-β 的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)可以部分解釋為什么 ASFV 的減毒活毒株仍然保留免疫抑制活性。鑒于 pS183L 是首個靶向 MDA5 以下調(diào) RLR 信號傳導(dǎo)的 ASFV 蛋白，作者后續(xù)的研究將集中于構(gòu)建 S183L 缺失的病毒，以評估其在體外和體內(nèi)對病毒復(fù)制的作用。

來源：Veterinary

編輯：吃一口小貓