2025年5月14日，我室馬明團隊在Nature Chemistry上發表了題為“Structural insights into two thiamine diphosphate-dependent enzymes and their synthetic applications in carbon–carbon linkage reactions”的研究論文。該研究首次闡明了一類催化分子間碳-碳鍵連接反應的ThDP-依賴酶的晶體結構、底物選擇性和立體選擇性機制，并通過酶的理性改造和酶法全合成制備了大量碳-碳鍵連接化合物。

維生素B1（硫胺素，thiamine）經磷酸化后即變成其輔酶形式焦磷酸硫胺素（thiamine diphosphate, ThDP），而ThDP-依賴酶參與氨基酸代謝和糖代謝等重要的初級代謝。比如在纈氨酸的生物合成中，ThDP-依賴酶催化途徑中的第一步反應：兩個丙酮酸的碳-碳鍵連接（圖1）。在該反應中，ThDP作為輔因子首先親核進攻第一個丙酮酸分子（acyl donor）形成一個Breslow中間體，然后該Breslow中間體親核進攻第二個丙酮酸分子（acyl acceptor），并隨著ThDP的離去形成碳-碳鍵連接產物（圖1）。

圖1 ThDP-依賴酶在纈氨酸生物合成中的催化功能和催化機制

ThDP-依賴酶在上述初級代謝中催化了兩個脂肪側鏈α-酮酸的碳-碳鍵連接（可歸為type I類反應，圖2），值得關注的是近年來發現ThDP-依賴酶也參與了一些天然產物（次級代謝產物）的生物合成（圖2），它們可以催化兩個芳香側鏈α-酮酸的碳-碳鍵連接（type II類反應）、脂肪側鏈α-酮酸作為acyl donor和芳香側鏈α-酮酸作為acyl acceptor的碳-碳鍵連接（type III類反應）、芳香側鏈α-酮酸作為acyl donor和脂肪側鏈α-酮酸作為acyl acceptor的碳-碳鍵連接（type IV類反應）（圖2）。然而截至目前，催化type II-IV類型的ThDP-依賴酶尚沒有三維結構研究，其如何選擇acyl donor和acyl acceptor的內在機制未知，這大大限制了它們在碳-碳鍵連接反應方面的催化應用。

圖2 ThDP-依賴酶催化的四類α-酮酸碳-碳鍵連接反應

基于上述科學問題，研究團隊從自建的海洋特殊生境細菌菌種庫中發現了一個天然產物（化合物1，圖3），它是一個ThDP-依賴酶催化的type II型反應產物。通過對產化合物1菌株（金色微菌

Chryseomicrobium

圖3 CsmA的來源菌株及其催化形成化合物1的過程

為了考察CsmA的底物雜泛性，研究團隊通過不同芳香側鏈α-酮酸底物的兩兩組合開展體外催化反應，發現它展示出強大催化能力，可以在溫和條件下催化一系列type II型α-酮酸碳-碳鍵連接反應，產生了35個α-酮酸連接產物及相應的70個NaBH4還原產物（圖4）。CsmA催化的立體選擇性由代表性產物的X-射線單晶結構得以確定。

圖4 CsmA催化的代表性type II型α-酮酸碳-碳鍵連接產物

研究團隊繼而以CsmA為模板在數據庫中搜索能夠催化其它反應類型的ThDP-依賴酶。通過進化樹分析從一株短芽孢桿菌

Brevibacillus migulae

圖5 BbmA催化的代表性type III型α-酮酸碳-碳鍵連接產物

CsmA和BbmA的發現為研究它們的底物選擇性機制提供了研究對象，因為它們接受同樣的芳香側鏈α-酮酸作為acyl acceptor，但是卻接受不同類型的α-酮酸作為acyl donor。研究團隊成功解析了CsmA與ThDP、BbmA與ThDP的復合物晶體結構（圖6）。晶體結構中ThDP的存在可以錨定acyl donor的結合口袋，因此通過比較CsmA-ThDP與BbmA-ThDP結構中acyl donor結合口袋周圍的氨基酸殘基，結合定點突變和體外催化表征，發現兩個氨基酸殘基即可決定acyl donor的選擇性（CsmA中的S110和T278，對應BbmA中的L112和W288，圖6）。通過對這兩個殘基的突變可以實現CsmA與BbmA催化類型的相互切換。

圖6 CsmA-ThDP和BbmA-ThDP的晶體結構和acyl donor結合口袋比較

為了探究acyl acceptor的底物選擇性機制，研究團隊進一步解析了BbmA與ThDP和HPPA的復合物晶體結構（圖7）。由于HPPA是BbmA催化過程中的acyl acceptor，因此可以方便地錨定acyl acceptor的結合口袋。通過對acyl acceptor結合口袋周圍氨基酸殘基的定點突變和體外功能表征，發現一個殘基（G484）即可決定其acyl acceptor的選擇性（圖7）。同時，該晶體結構還揭示了BbmA催化立體選擇性的結構基礎：由于R556與HPPA中羧基的鹽橋作用使Breslow中間體只能從HPPA中α-羰基的

Si

圖7 BbmA-ThDP-HPPA的晶體結構及其acyl acceptor結合口袋

至此，通過上述晶體結構和關鍵氨基酸突變研究，成功揭示了決定CsmA與BbmA的底物選擇性機制和立體選擇性機制。在此基礎上的突變改造可以實現它們對acyl donor和acceptor的自由切換，產生全部type I-IV四種類型α-酮酸連接反應（圖8）。其中通過單突變體CsmAG466F或者三突變體BbmAL112S/W288T/G484F的底物擴展，成功制備了33個type IV型α-酮酸連接產物及相應的66個NaBH4還原產物。

圖8 CsmA和BbmA的理性突變改造實現了type I-IV四種碳-碳鍵連接反應類型

最后，為了驗證CsmA和BbmA在復雜化合物碳骨架構建中的催化潛力，研究團隊構建了呋喃內酯類抗生素的酶法全合成體系。將CsmA、BbmA或者它們的突變體與其他酶“一鍋”混合，通過定向提供不同的簡單小分子原料，可以實現呋喃內酯類抗生素γ-內酯母核上α、β、γ三個位置取代基的理性替換和修飾，產生了36個呋喃內酯類抗生素類似物（包括31個新化合物，圖9），其中包括了眾多非天然氨基酸結構片段。

圖9 新穎呋喃內酯類化合物的酶法全合成

綜上所述，該研究創新性和價值體現在：（1）系統性研究了在次級代謝途徑中催化α-酮酸碳-碳鍵連接反應的ThDP-依賴酶，并首次闡明了它們的晶體結構、催化底物選擇性和立體選擇性機制。（2）雖然目前已有一些模擬ThDP-依賴酶的仿生催化研究，但在這些化學反應中如何實現特定acyl donor和acceptor的選擇仍具有極大困難。而該研究發現并改造的兩個ThDP-依賴酶可以實現α-酮酸的定向異源二聚。它們的底物擴展制備了120個α-酮酸連接產物及相應240個NaBH4還原產物，其中包括了354個新化合物，這些化合物可以作為結構單元用于更加復雜化合物的酶法合成或者化學合成。（3）利用兩個ThDP-依賴酶實現了36個呋喃內酯類化合物的酶法全合成，體現了酶催化在復雜結構化合物碳骨架構建和結構多樣化擴展中的巨大潛力。

該研究由研究團隊三位博士后和一位博士生共同合作完成，北京大學藥學院博士后劉談、王貴陽、于佳慧，以及博士生李夢媛為共同第一作者，北京大學藥學院馬明教授為通訊作者。該工作得到北京大學藥學院楊東輝研究員、葉敏教授、黎后華研究員，北京大學生命科學學院蘇曉東教授以及北京大學基礎醫學院姜長濤教授的支持與幫助。同時還得到天然藥物及仿生藥物全國重點實驗室儀器平臺的尹富玲/賈紅麗（X-射線晶體衍射測試）、李勤/劉芬（核磁共振測試）、李軍/馬雯（液相-質譜測試）等老師的大力支持！

第一作者：

左起：劉談（博士后）、王貴陽（博士后）、于佳慧（博士后）、李夢媛（博士生）

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41557-025-01822-y

通訊作者簡介：

馬明，北京大學博雅特聘教授，國家杰出青年科學基金獲得者，北京大學藥學院、天然藥物及仿生藥物全國重點實驗室研究員，博士生導師。研究領域為天然藥用分子的發現和生物合成。近5年以通訊作者在Nat Chem、JACS、Angew Chem Int Ed、ACS Catal、Chem Sci、Acta Pharm Sin B等國際學術期刊發表SCI論文20余篇。任中國藥學會海洋藥物專業委員會委員、中國植物學會植物化學與資源專業委員會委員、中華中醫藥學會青年委員會委員、北京藥學會天然藥物專業委員會委員、國際期刊Chinese Journal of Natural Medicines編委會委員。