自噬（ Autophagy ）是一種通過包裹、降解細胞內損傷或多余組分來維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要過程。自噬的完成依賴一系列高度協(xié)調的膜動態(tài)事件，其中自噬體與溶酶體的融合是關鍵步驟。這一過程中，小 GTP 酶 RAB7A 作為核心調控因子，其 功能依賴于非活性狀態(tài)（結合 GDP ）和活性狀態(tài)（結合 GTP ）之間的循環(huán)轉換，而這種轉換需由 GEF （鳥苷酸交換因子）和 G AP （ G TP 酶激活蛋白）催化完成 。 在酵母中， MON1-CCZ1 復合體 已被證實是 Ypt7 （ RAB7 的酵母同源物）的特異性 GEF ，該復合體 在細胞內 的 定位和調控 機制 一直是結構與細胞生物學研究的熱點。然而 ，在高等哺乳動物中， M ON1-CCZ1 復合體 如何 特異性 識別 RAB7A 、介導 GDP 釋放并促進 GTP 結合的分子機制，迄今仍未完全闡明。這一關鍵科學問題的解答對于深入理解自噬調控網絡具有重要的理論價值。

近日 ， 四川大學華西醫(yī)院生物治療全國重點實驗室戚世乾課題組和清華大學生命科學學院 / 北京生物結構前沿研究中心王佳偉課題組合作， 在Life Metabolism發(fā)表 了 題為Cryo-EM structure of the humanMON1A-CCZ1-RAB7A complex provides insights into nucleotide exchange mechanism的 研究論文 ， 該研究通過冷凍電鏡技術 首次解析了人源 MON1A-CCZ1 (HsMC1) 和 RAB7A N125I （無核苷酸突變）形成三元復合體的高分辨三維 結構 ，成功揭示了 HsMC1 與 RAB7A 相互作用 的關鍵 分子 界面及 其 構象變化， 并通過體外核苷酸交換實驗驗證了重要的 GEF 活性調控位點。 通過將 R AB7A N125I 與不同核苷酸結合狀態(tài)下的 R AB7A 結構進行比較分析， 結果表明， HsMC1 通過誘導 RAB7A Switch I 、 Switch II 和 P-loop 區(qū)域發(fā)生構象變化， 促進 R AB7A 由 GDP 結合狀態(tài)向 GTP 結合狀態(tài)的轉換。 值得注意的是， 該研究在哺乳動物中發(fā)現了 MON1A-CCZ1 可調控 RAB7A P-loop 的構象變化，對于深入解析 R AB GTP ase 的核苷酸交換機制提供了新的見解。

該團隊通過在 Sf9 細胞中共表達 RAB7A N125I 突變體和 MON1A (98-652)-CCZ1 復合體，成功得到了分子量均一、蛋白性質良好的三元復合體（圖1a）。 MON1A 和 CCZ1 各自包括三個 LD 結構域（ LD1-LD3 ） ， 并通過 LD1 和 LD3 形成異二聚體。 MON1A 和 C CZ1 中的 LD1 結構域分別介導了與 RAB7A 的相互作用（圖1b）。

在 MON1A-CCZ1 結合下， RAB7A N125I 的 Switch I 、 Switch II 和 P-loop 都發(fā)生了構象變化。值得注意的是， P-loop 的構象變化在之前解析的 Chaetomium thermophilum （ Ct ） Y pt7 N125I 中尚未觀察到（圖1c）。此外，研究人員還檢測了 R AB7A P- loop 中與 CCZ1 相互作用的 S17 殘基在核苷酸交換中的功能，結果發(fā)現該位點突變后大大降低了 R AB7A 對 HsMC1 的 GEF 活性響應（圖1d）。

總之， 研究團隊解析了 HsMC1 與 RAB7A 與形成復合體的冷凍電鏡結構，捕捉到了 R AB7A 的無核苷酸狀態(tài)。生化實驗證實了 HsMC1 調控 RAB7A 的關鍵氨基酸， HsMC1 通過與 RAB7A 的 Switch II （ R 69 、 R 79 ）和 P-loop （ S 17 ）相互作用，介導了 RAB7A 在核苷酸交換中的構象改變。 基于這些發(fā)現，本研究提出了 HsMC1 介導 RAB7A 的核苷酸交換機制模型（圖1e）。 HsMC1 結合 RAB7A 后，誘導其 Switch I 、 Switch II 和 P - loop 發(fā)生構象變化，降低 R AB7A 對核苷酸的親和力，從而促進后續(xù)的核苷酸置換過程。 Switch I 中的 K38 插入鎂離子配位的位置，進而驅逐鎂離子。 Switch I 中的 F33 、 Y37 和 I41 發(fā)生構象重排，與 MON1A 形成疏水相互作用。與此同時， P-loop 發(fā)生構象變化，向鎂離子配位的位置靠近。這些構象重排協(xié)同作用，進一步削弱了 R AB7A 對核苷酸的親和力。 Switch II 則轉變?yōu)榉€(wěn)定的螺旋構象，有利于 R AB7A 與 GEF 的結合，并維持 G EF-RAB 復合體的穩(wěn)定。在 HsMC1 介導核苷酸釋放后， G T P 被加載， R AB7A 恢復到其活性構象。當 RAB7A 與 G TP 結合時， Switch I 與 P-loop 恢復原位，而 Switch II 則由螺旋狀態(tài)轉為較不穩(wěn)定的構象。該過程最終激活 RAB7A ，使其能夠結合并招募下游效應因子。

圖1: MON1A-CCZ1-RAB7AN125I復合體結構及RAB7A核苷酸交換機制

四川大學生物治療全國重點實驗室戚世乾教授和清華大學生命科學學院 / 北京生物結構前沿研究中心王佳偉副教授為本文共同通訊作者。四川大學 2022 級碩士生李昕娜、清華大學 2021 級博士生李丹、四川大學華西醫(yī)院唐丹副研究員為本文共同第一作者。電鏡數據采集在國家蛋白質科學研究（北京）設施的冷凍電鏡平臺完成。

https://academic.oup.com/lifemeta/advance-article/doi/10.1093/lifemeta/loaf017/8149154

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