研究背景

氧化應激由自由基和抗氧化劑不平衡引發，導致活性分子積累，與心血管疾病、癌癥、糖尿病、免疫疾病及青光眼、糖尿病性視網膜病變、年齡相關性黃斑變性（AMD）等視網膜疾病的發生發展密切相關，視網膜組織因高代謝活性和持續暴露于光線易受氧化應激影響，過度的光照會增加活性氧（ROS）的產生，加劇氧化應激并損害視網膜細胞，視網膜色素上皮（RPE）、光感受器和視網膜神經節細胞（RGC）特別容易受到氧化損傷，這種損傷會導致視力喪失和細胞死亡。視網膜疾病治療最新進展集中在基因治療、干細胞治療和藥理學創新上，但現有治療存在高成本、對復雜醫療保健基礎設施需求及潛在長期安全問題等限制。為應對挑戰，研究重點轉向開發用于玻璃體內注射的富含抗氧化劑的水凝膠，這些水凝膠通過直接靶向氧化應激提供持續和局部治療效果，由親水性聚合物組成的可注射水凝膠徹底改變了微創醫學治療，能融入生理環境、提供持續功能性能并參與組織修復。明膠因生物相容性和多功能性廣泛用于組織工程，基于明膠的生物材料常被改性以調節或增強性能，但明膠甲基丙烯酰（GelMA）缺乏特定治療特性和注射性，限制了其應用，為此開發了基于抗氧化明膠的水凝膠，如GelCA、沒食子酸共軛的明膠摻入明膠羥苯基丙酸形成的水凝膠及Gtn-HPA和HA-Tyr偶聯水凝膠等，這些水凝膠能改變人類視網膜祖細胞的細胞行為，是潛在細胞療法中細胞遞送的有前途選擇，此外，具有強大抗氧化和抗炎特性的咖啡酸（CA-2OH）因其與天然粘合劑成分結構相似性，可增強水凝膠粘合性能，在組織修復應用中具有潛在有效性 。

主要內容

在本研究中，我們借助碳二亞胺反應以及與微生物轉谷氨酰胺酶（mTG）的酶促交聯，開發出創新的明膠 - 咖啡酸（GelCA - 2OH）和明膠 - 咖啡酸寡聚物（GelCAo2OH）水凝膠，同時采用氧化法使咖啡酸低聚化以增強水凝膠的生物粘附性和抗氧化性能。這些水凝膠專為玻璃體內注射設計，旨在向受損視網膜組織局部且持續輸送抗氧化劑，通過融合明膠的結構優勢與咖啡酸及其低聚物的強大抗氧化特性，可有效減輕氧化損傷。此外，我們在視神經擠壓（ONC）模型中評估了這些水凝膠的體內功能與治療效果，以期推動視網膜疾病治療的發展。

圖 1.咖啡酸改性明膠水凝膠的合成和應用在視網膜內組織修復中的應用。CA 被氧化形成 CAo，然后與明膠偶聯并使用 mTG 交聯以產生 GelCAo-2OH 水凝膠。水凝膠顯示 ROS 水平、炎癥和 RGC 死亡顯著降低。這突出了它作為抗氧化劑的有效性、相容性以及玻璃體內注射的適用性。CA，咖啡酸;Cao，咖啡酸低聚物;mTG，微生物轉谷氨酰胺酶;ROS，活性氧，RGC，視網膜神經節細胞。

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咖啡酸改性明膠水凝膠的合成

圖 2a 展示了 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 的合成，即咖啡酸通過羧基與明膠氨基形成胺鍵共價結合。為確認結合成功，將 GelCA-2OH 的紫外 - 可見光譜與未修飾明膠和咖啡酸光譜比較，發現明膠 - 咖啡酸偶聯物在 294 nm 和 318 nm 處有對應 CA2OH 的吸收峰，且 GelCAo2OH 組特征峰吸光度值增加，表明 CA2OH 成功整合到明膠骨架；質子核磁共振波譜進一步驗證，CA-2OH 有特征化學位移，合成樣品譜圖顯示與 CA-2OH 對應的額外峰，證實咖啡酸成功摻入明膠基質；采用茚三酮反應測定胺取代水平，發現 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 組顏色強度和吸光度值低于未修飾明膠組，計算得 GelCA-2OH 的功能化程度（DoF）為 15.3% ± 0.1%，GelCAo2OH 的為 22.7% ± 0.3%，低胺取代水平表明需增強改性策略；傳統偶聯方法因明膠偶聯位點有限致兒茶酚結合低，故實施涉及 CA-2OH 寡聚化的先進方法，在 EDC/NHS 偶聯前將咖啡酸氧化成低聚物，顯著增加鄰苯二酚含量，Arnow 測定證明兒茶酚濃度和吸光度存在線性關系（R = 0.9963），且 GelCAo-2OH 中的兒茶酚含量顯著高于 GelCA-2OH（分別為 16.9 和 10.2 μg mg），是 GelCA-2OH 的 ≈1.7 倍，表明通過寡聚化成功增強明膠功能，符合增強明膠生化性質的目標 。

圖 2.咖啡酸改性水凝膠的合成和化學表征。a） 使用 mTG 酶溶液用咖啡酸低聚物進行明膠功能化和 GelCAo-2OH 的酶促交聯示意圖。b） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的紫外-可見光譜。c） 咖啡酸、明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的 1 H NMR 波譜。d） 改性和未改性明膠中咖啡酸功能化程度（SD ±平均值，n = 3）。e） 兒茶酚濃度的標準曲線（520 nm 處的吸光度）。f） 修飾和未修飾明膠中兒茶酚含量的鑒定（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：** P < 0.01 和 **** P < 0.0001，通過雙向方差分析后跟 Tukey 事后檢驗）。

咖啡酸改性明膠水凝膠的交聯動力學和可注射性

我們開展詳細流變學分析以研究水凝膠高級物理化學性質，使用復雜流變儀觀察從與 mTG 整合的改性和未改性明膠溶液開始、在室溫下酶促交聯的凝膠化過程，通過優化重量濃度確定 3 wt% 為最佳濃度，所有配方儲能模量（G′）和損耗模量（G“）逐漸增加，凸顯 mTG 加速凝膠化的作用，但 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的 G′ 值低于未修飾明膠，可能因兒茶酚修飾干擾明膠天然三螺旋結構、阻礙有效網絡形成，且交聯效率受空間位阻影響；觀察到 GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠粘度隨剪切速率提高顯著降低，冪律模型顯示其流動指數（n 值）和稠度指數（K 值）均低于明膠，明顯的剪切稀化行為表明咖啡酸改性增強了水凝膠在剪切應力下變粘稠的能力，利于細針擠出應用；水凝膠光學圖像顯示明膠高透明度，透射率平均值為 80.98%，GelCA-2OH 呈乳白色，平均透射率為 35.9%，歸因于咖啡酸官能團摻入影響光學特性，添加氧化試劑后咖啡酸氧化使 GelCAo-2OH 色偏過渡且透明度降低，不過 GelCAo-2OH 透射率略高于 GelCA-2OH，可能因兒茶酚整合破壞水凝膠網絡內聚力，減少內部光散射，盡管 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 透射率均低于明膠但仍保持一定透明度，且二者均具有可生物降解性，注射到眼睛中可在體內逐漸降解以降低阻礙視力風險；評估水凝膠體積和透射率關系表明，注射的 GelCAo-2OH 和 GelCA-2OH 保持高光學清晰度，在小鼠眼睛 ONC 模型體內抗氧化性能研究中注射 ≈10 μL 水凝膠進行治療，可最大限度減少對視覺功能的影響 。

圖 3.咖啡酸改性明膠水凝膠的交聯動力學和注射性評估。a） 添加 mTG 溶液 10 分鐘和 30 分鐘前后明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的照片。b） 使用 mTG 溶液評估 GelCA-2OH 溶液酶促交聯的實驗設計。c） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的時間依賴性儲能模量 （G′） 和損耗模量 （G”）。d） 通過 30G 針頭注射 GelCAo-2OH 水凝膠。e） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的光學圖像。f） 使用透射儀測量明膠、GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 的透明度（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：* P < 0.05，通過雙向方差分析，然后進行 Tukey 事后檢驗）。g） GelCAo-2OH 水凝膠的粘度曲線以及 1 至 100 秒的剪切速率。

咖啡酸改性明膠水凝膠的機械性能

對改性和未改性明膠水凝膠的振蕩流變學分析顯示，當振蕩應變從 1% 增加到 1000% 時，G′ 相對降低，估計明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的臨界振蕩應變分別為 259.73%、259.01% 和 253.95%；進行一系列從低（1%）到高（300%）應變的三個循環應變測試后，與同等濃度未修飾明膠水凝膠相比，咖啡酸修飾的水凝膠尤其是 GelCAo-2OH 組的 G′ 值變化最小，計算出的明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的 G′ 平均修復率分別為 63.0% ± 3.8%、93.9% ± 3.6%、99.0% ± 2.7%，表明咖啡酸修飾水凝膠具有卓越的自愈能力，這歸因于通過增強的π - π 相互作用和咖啡酸中酚羥基的氫鍵形成的密集結區網絡，使其在應力下可轉變為流體狀態并恢復原始機械特性，展現出用于玻璃體內注射的潛力；為闡明壓縮力下的材料特性，分析改性和未改性水凝膠的壓縮行為，應力 - 應變曲線揭示機械響應差異，未改性明膠在 1.0 應變下承受的最大應力約為 15 kPa，改性的 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠的峰值應力分別為 6.6 和 4.1 kPa，GelCAo-2OH 抗壓強度降低尤為明顯，證實早期流變學發現，表明軟材料特性，這種抗壓強度降低可能因結構兒茶酚整合誘導的改變，兒茶酚基團雖旨在增強交聯但也可能削弱水凝膠網絡內聚力，定量楊氏模量測量也支持該假設，明膠模量為 3.2 ± 0.4 kPa，超過 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的模量（分別為 1.7 ± 0.4 和 1.0 ± 0.2 kPa），表明鄰苯二酚添加引起的結構修改可能引入復雜性，如空間位阻，影響水凝膠的壓縮彈性 。

咖啡酸改性明膠水凝膠的粘附性能

評估 CA 改性明膠水凝膠粘附性能的實驗裝置采用以豬皮為基材的拉伸強度測試，制備豬皮樣品并粘附在基于明膠的水凝膠上以保證接觸一致，隨后將組件放入配備夾具固定樣品的機械測試設備中。對粘合測試數據分析發現，粘附強度 - 位移曲線顯示 GelCAo-2OH 粘附強度最高，在 ≈35 kPa 達到峰值，GelCA-2OH 約為 26 kPa，未改性明膠水凝膠為 18 kPa，進一步量化與統計分析最大粘合強度值也證明 GelCAo-2OH 粘合性能明顯優于 GelCA-2OH 和明膠，其增強的粘合強度可歸因于兒茶酚基團密度增加，促進了與豬皮的有效相互作用，該結果凸顯了 CA 改性明膠水凝膠在需強大粘附力的生物醫學應用中的潛力。

圖 4.咖啡酸改性明膠水凝膠的機械和粘附性能評估。a） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠的儲能模量 （G′） 和損耗模量 （G“） 以及從 1% 到 1000% 的振蕩應變。b） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠的儲能模量 （G′） 和損耗模量 （G“） 以及 1% 至 300% 之間的 3 次應變循環。c） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠在 1% 和 300% 之間的 3 個應變循環后 G′ 恢復率（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：*** P < 0.001 通過雙向方差分析，然后進行 Tukey 事后檢驗）。d） 基于明膠的水凝膠的機械壓縮測試的實驗裝置。e） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的應力-應變曲線。f） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的楊氏模量（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：** P < 0.01 和 *** P < 0.001，通過雙向方差分析后跟 Tukey 事后檢驗）。g） 粘附在兩塊豬皮之間的水凝膠粘合強度測試的實驗裝置。h） 明膠、GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 的粘附強度。i） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的最大粘附強度（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：* P < 0.05 和 *** P < 0.001，通過雙向方差分析后跟 Tukey 事后檢驗）。

咖啡酸改性明膠水凝膠的結構分析和生物降解

我們借助掃描電子顯微鏡（SEM）在微米尺度檢查發現，未改性明膠水凝膠呈相對均勻緊湊的多孔 3D 形態，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 孔結構更異質、不規則，GelCAo-2OH 孔結構更多樣化，這歸因于兒茶酚基團整合破壞了明膠基質均勻性；顯微計算機斷層掃描（Micro-CT）分析顯示，兒茶酚修飾使水凝膠孔隙率略有增加，孔徑也有所擴展，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 內部組成更碎裂、不緊湊，這些形態變化可能影響水凝膠機械性能，降低其承受壓縮力能力，表明基質內有效交聯減少，凸顯鄰苯二酚修飾在增強生化特性與損害結構內聚力和機械穩健性間的微妙平衡對改性水凝膠臨床應用的重要性；明膠、GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠均表現出快速吸水率，4 小時內穩定在 ≈300%，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 孔隙率增加可能增強其保持水分能力，利于細胞遷移和增殖，且鄰苯二酚引入的結構修飾未損害明膠親水性，水凝膠保持所需水分含量，平衡的吸水能力及調整后的孔隙率說明其在眼部應用中具有發揮最佳功能的潛力；在酶降解方面，改性水凝膠尤其是 GelCAo-2OH 比未改性明膠降解更快，這種加速降解利于視網膜組織修復，避免長期異物并發癥，GelCAo-2OH 降解速度更快，適用于需瞬時支持的應用，孔徑和結構碎裂增加可能增強酶可及性，可優化降解速率；水凝膠降解時接枝的咖啡酸會釋放，釋放實驗表明，通過 EDC/NHS 化學將咖啡酸偶聯到明膠上能有效穩定官能團，7 天后 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 僅釋放極少量咖啡酸，驗證了化學改性的穩定性；分析釋放動力學對了解水凝膠治療潛力和生物利用度至關重要，通過將數據擬合到五個不同模型，發現樋口模型最能描述 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的釋放動力學，該模型在現代藥物輸送技術中發揮重要作用，能準確預測釋放速率，是配方設計的寶貴工具 。

咖啡酸改性明膠水凝膠的抗氧化活性

為探索水凝膠在視網膜保護方面尤其是具有增強抗氧化能力水凝膠的功效，我們聚焦于以抗氧化和抗炎特性聞名的 CA-2OH。在受控條件下，通過 2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（DPPH?）測定評估不同濃度 CA-2OH 的自由基清除效率，發現低濃度（0.125 mg mL）CA-2OH 清除自由基非常有效，中和率超 90%，凸顯其強大抗氧化能力，且 DPPH? 測定中水凝膠性能進一步證明其抑制自由基能力，CA-2OH 和 CAo2OH 與明膠結合顯著增加 DPPH? 抑制，體現咖啡酸整合增強抗氧化活性，不過向明膠添加大量羥基使抗氧化效率適度提高，表明修改有效性存在潛在閾值；進一步研究水凝膠清除超氧陰離子（O?）能力，實驗顯示標準明膠水凝膠 O? 清除能力適中，僅為 ≈11%，而添加咖啡酸顯著提高明膠水凝膠清除能力，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 樣品清除效率分別達 48.1% ± 2.0% 和 53.9% ± 1.5%，結合 DPPH? 清除測試結果，表明咖啡酸摻入后水凝膠 ROS 清除效率顯著提高；此外，利用電子順磁共振（EPR）波譜評估水凝膠 ROS 清除能力，對照組觀察到 DPPH? 自由基特征峰，明膠組峰值強度降低但仍可檢測，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 組未觀察到明顯峰值，表明咖啡酸修飾后其抗氧化能力顯著增強，這些發現與 DPPH? 測定和硝基藍四唑（NBT）測定結果一致 。

圖 5.咖啡酸改性明膠水凝膠的形態、物理和化學性質評估。a） 掃描電子顯微鏡圖像，說明明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠的橫截面形態（比例尺：400 μm）。b） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的吸水動力學（SD ±平均值，n = 3）。c） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝膠的顯微 CT 圖像。d） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的酶降解曲線（SD ±平均值，n = 3）。e） DPPH? 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 的清除活性（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：*** P < 0.001，**** P < 0.0001，通過雙向方差分析后跟 Tukey 事后檢驗）。f） 明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的清除活性（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：* P < 0.05 和 **** P < 0.0001，通過雙向方差分析，然后進行 Tukey 事后檢驗）。g） 比色變化對應于不同測定條件下水凝膠制劑中抗氧化活性的存在和功效。

咖啡酸改性明膠水凝膠的體外生物相容性

為評估 CA 修飾和未修飾的明膠水凝膠的體外生物相容性，我們依據 ISO 10993-5 標準，分別采用細胞計數試劑盒 8（CCK-8）和活/死測定進行定量與定性評估，這些測定對評估水凝膠與源自小鼠視網膜且廣泛用于視網膜疾病研究的 RGC-5 細胞和 661W 細胞的相互作用至關重要。CCK-8 檢測作為定量評估細胞活力的方法，結果顯示所有水凝膠制劑組細胞活力與在組織培養板對照上培養超過 48 小時的細胞活力相當，表明水凝膠中不存在破壞細胞代謝的細胞毒性試劑，證實其適合用于治療；活/死測定從定性角度支持該發現，與水凝膠提取物孵育 48 小時后，大多數細胞呈綠色熒光（表明活力），僅有最小紅色熒光（表明細胞死亡），進一步證實了水凝膠的無毒性質及其有效支持細胞活力的能力。

圖 6.咖啡酸改性明膠水凝膠的體外生物相容性性能。a） 暴露于水凝膠提取物的 RGC-5 細胞在 48 小時時的活/死染色（比例尺：400 μm）。b） 暴露于水凝膠提取物的 RGC-5 細胞在 4、24 和 48 小時時的活力比較（平均 ± SD，n = 3）。

咖啡酸改性明膠水凝膠的體外抗氧化性能

為全面評估咖啡酸修飾的明膠水凝膠 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的抗氧化特性，我們利用 RGC-5 細胞在過氧化氫（H?O?）誘導的氧化應激下開展體外測定實驗，借助能精確定量細胞內 ROS 的熒光探針二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）進行評估。實驗將 RGC-5 細胞暴露于含 500 μm H?O?的培養基模擬氧化環境，以此評估各水凝膠變體的保護功效。DCFH-DA 測定呈現熒光指示 ROS，定量分析表明，與僅用 H?O?處理的對照組相比，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 組的 ROS 積累顯著減少，雖兩種制劑抗氧化活性均有效且性能差異小，但即便 GelCAo-2OH 咖啡酸濃度較高，在降低 ROS 水平方面也僅略優于 GelCA-2OH，熒光強度測量證實了這一點，凸顯了 CA 濃度與水凝膠抗氧化功效的相關性。ROS 逐漸降低且咖啡酸增加，表明明膠結構修飾既能保持細胞活力，又能增強細胞微環境以防止氧化損傷，這對如視網膜疾病治療等普遍關注氧化應激的臨床應用尤為有利，突出了 CA 修飾水凝膠作為視網膜組織修復中針對氧化應激治療策略的潛在價值。

圖 7.咖啡酸改性明膠水凝膠的體外抗氧化性能。a） 使用 DCFH-DA 和 Hoechst 染色（比例尺：200 μm）定量評估暴露于水凝膠的 RGC-5 細胞中的 ROS 清除和細胞核可視化。b） RGC-5 細胞培養物中水凝膠處理和 ROS 染色的實驗時間表。c） 在氧化應激下用水凝膠處理的 RGC-5 細胞的相對 DCFH-DA 熒光強度（平均值± SD，n = 3，統計顯著性表示如下：** P < 0.01 和 **** P < 0.0001，然后進行 Tukey 事后檢驗）。

咖啡酸改性明膠水凝膠的體內生物相容性性能

為研究不同水凝膠制劑的體內生物相容性，我們對健康小鼠進行玻璃體內注射，并分別在注射后即刻（第 0 天）和注射后 7 天（第 7 天）評估視網膜組織完整性。初步觀察及第 0 天的組織學分析證實水凝膠成功輸送至玻璃體腔，第 7 天的后續評估顯示，所有水凝膠組的關鍵視網膜層完整性得以保持，詳細組織學染色表明神經節細胞層（GCL）、內核層（INL）或外核層（ONL）均未出現破壞。這些發現表明水凝膠耐受性良好，無誘導細胞丟失、組織變性或炎癥反應的證據，視網膜結構的保留及無不良反應凸顯了水凝膠與視網膜組織的相容性，支持其在眼部疾病治療應用中的潛在效用，也突出了這些水凝膠制劑在提升再生眼科臨床結果方面的潛力。

圖 8.咖啡酸改性明膠水凝膠的體內生物相容性性能。a） 可注射水凝膠體內生物相容性測試的時間表。b） 第 0 天和第 7 天視網膜組織對 PBS、明膠、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 反應的組織學分析（比例尺：50 μm）。

咖啡酸改性明膠水凝膠在 ONC 模型中的體內抗氧化性能

我們通過在 6 周齡雌性癌癥研究所（ICR）小鼠中建立視神經夾傷（ONC）模型來評估 CA 修飾和未修飾的明膠水凝膠的抗氧化功效，先對小鼠麻醉并實施精確外科手術暴露視神經，用交叉作用鑷子對視神經施加 10 秒受控壓力以建立氧化應激模型。ONC 誘導后，將水凝膠制劑直接注射到眼睛玻璃體中研究原位治療潛力，重點評估水凝膠調節視網膜組織中氧化應激的能力，使用對 ROS 敏感的二氫乙錠（DHE）染色定量評估氧化應激，氧化后 ROS 發出熒光可可視化和量化視網膜組織內氧化應激水平。DHE 染色視網膜切片的顯微鏡分析及量化顯示，與 PBS 處理的 ONC 對照組相比，兩種水凝膠制劑都顯著減少 ROS 積累，富含最高咖啡酸濃度的 GelCAo2OH 水凝膠使熒光強度降低最明顯，表明咖啡酸含量增加可能增強水凝膠抗氧化特性，且 ROS 在視網膜神經元各層（GCL、INL 和 ONL）積累，咖啡酸的抗氧化性能在實驗組各視網膜層均有良好記錄，尤其在 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 組。總體而言，咖啡酸修飾的水凝膠有效減輕 ONC 后視網膜組織的氧化應激，其抗氧化能力對保護和再生視網膜神經元組織的治療應用至關重要，在損傷或疾病誘導的氧化應激條件下，這些水凝膠降低 ROS 水平、減輕氧化損傷的能力，突出了它們在臨床治療視網膜神經退行性疾病的潛在效用。

圖 9.咖啡酸改性明膠水凝膠的體內抗氧化性能。a） 小鼠視網膜中 ROS 誘導和水凝膠治療的時間表。b） 暴露于水凝膠的視網膜組織中的相對 DHE 熒光強度（SD ±平均值，n = 3，統計顯著性表示如下：**** P < 0.0001 通過雙向方差分析，然后是 Tukey 事后檢驗）。c） 使用視網膜組織的 DHE 染色可視化 ROS 積累，包括 GCL、INL 和 ONL（比例尺：100 μm）。

咖啡酸改性明膠水凝膠處理 RGC 的體內存活率

為證實水凝膠治療效果，我們評估視網膜細胞存活率（圖 10a 展示相關實驗示意圖）。RBPMS 是 RNA 結合蛋白，在視網膜 RGC 中選擇性表達，是識別和量化視網膜組織中 RGC 的可靠標志物，常用于估計眼神經病變等情況下的 RGC 丟失。RBPMS 免疫熒光染色結果（圖 10c）顯示，PBS 注射無 ONC 的對照組 GCL 無顯著降低或變性，而 ONC 組注射 PBS 后 RBPMS 陽性細胞顯著減少，表明神經節細胞顯著丟失；ONC 后用明膠處理的組 RBPMS 陽性細胞減少，與 ONC 組細胞丟失一致，表明未修飾明膠不能治療急性 ROS 損傷的視網膜組織；相反，與 ONC 組相比，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 注射組 RBPMS 陽性細胞增加，表明對 RGCs 有保護作用，可防止視神經損傷后 RGC 丟失。圖 10b 的 RGC 密度統計分析證實，ONC 減少 GCL 中細胞數量，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 注射顯著減輕了這種減少。

圖 10.用咖啡酸改性明膠水凝膠處理的 RGC 的體內存活率。a） 小鼠視網膜中 ROS 誘導和水凝膠治療的時間表。b） RBPMS 細胞的定量分析，以及代表性成像。（SD ±平均值，n = 4，統計顯著性表示如下： ** P < 0.01 和 **** P < 0.0001，通過雙向方差分析，然后進行 Tukey 事后檢驗。c） 用 RBPMS 對視網膜細胞進行免疫熒光染色，用 Hoechst33342 對視網膜細胞進行核染色（比例尺：100 μm）。

此外，我們對 RPE 進行全安裝染色以觀察組織和 RGC 的 3D 結構（全安裝過程見圖 S10），結果顯示與對照組相比，ONC 組 RBPMS 信號明顯較弱，明膠組略高，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 均將 RBPMS 信號恢復到與未處理對照組相當水平；為量化水凝膠保存 RGC 的治療效果，使用 ImageJ 軟件自動細胞計數，發現 GelCAo-2OH 組 RGC 細胞總密度和比例顯著增加，GelCA-2OH 和明膠組無顯著改善。值得注意的是，這些發現與組織學切片染色結果不同，切片染色實驗中 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 組在 RBPMS 陽性細胞計數或體內抗氧化性能方面無顯著差異，這表明切片染色因主要提供單層透視，在捕獲細胞和組織完整 3D 結構方面受限。總體而言，RPE 整裝分析表明 GelCAo-2OH 對視神經損傷后 RGC 丟失更有效，這種保護作用可能源于其增強減輕氧化應激的能力。為進一步評估水凝膠對視神經損傷的保護和再生作用，進行 GAP-43 軸突染色，結果顯示 ONC 治療后熒光強度顯著降低、細胞密度顯著降低，而 GelCAo-2OH 注射組熒光強度顯著恢復，表明其在促進軸突再生方面潛力廣闊。

圖 11.用咖啡酸修飾的明膠水凝膠處理的 RGC 體內存活的全量分析。a） 10× 物鏡下的代表性圖像（比例尺：1 毫米）。b） RPE 整個安裝的示意圖，包括全視場視圖和四個放大區域。c） 40× 物鏡下的代表性圖像（比例尺：100 μm）。

圖 12.a） 總細胞密度和 b） RGC 細胞密度的定量分析，以及代表性成像。（均值± SD，n = 4，統計顯著性表示如下： * P < 0.05，** P < 0.01，**** P < 0.0001，通過雙向方差分析后跟 Tukey 事后檢驗。c） RGC 細胞比率的定量分析，計算方法是 RGC 細胞數除以總細胞數。

參考文獻

Kai-Hsiang Chang, Jwu-Jiun Wei, Guan-Yu Lan, Yi-Ke Lin, Yu-Ting Lin, Ta-Ching Chen, and Jiashing Yu

Minimally Invasive, High Transmittance, Adhesive and Antioxidative Hydrogel Complex for Treatments of Both Optic Neuropathy and Retinopathy

ADVANCED HEALTHCARE MATERIALS

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https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202501583

來源：納米醫韻