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麻醉狀態下的雙光子鈣成像

為實現麻醉狀態下的雙光子鈣成像，將小鼠右側初級聽覺皮層暴露出來。手術過程簡述如下：小鼠先被麻醉，并置于恒溫板上（37.5-38°C）。注射了局麻藥利多卡因后，將覆蓋在初級聽覺皮層上面的皮膚和肌肉去除。接著會用氰基丙烯酸鹽粘合劑將一個自制的塑料顱骨固定裝置粘附到小鼠初級聽覺皮層所在的顱骨上，在此基礎上，用手鉆將顱骨去除，進而將初級聽覺皮層腦表面暴露出來（中心點：前囟往后2.5mm，中線旁開4.5mm）。之后，小鼠會被轉移至雙光子實驗記錄臺，同時異氟烷濃度會降低至0.4-0.8%，小鼠的呼吸頻率保持在90-130次/分。暴露出來的小鼠初級聽覺皮層腦表面會覆蓋有不斷循環的pH值為7.4的人工腦脊液。

使用高敏感度鈣離子指示劑Cal-520酯類作為初級聽覺皮層多細胞標記的染料。在20%普朗尼克F-127的輔助下，Cal-520酯類溶于DMSO，經人工腦脊液稀釋后得到終濃度為567μM的鈣染料。標記初級聽覺皮層的第5層神經元，裝有染料的玻璃電極經由腦表面硬腦膜插入皮層下600微米才開始注射。鈣染料標記操作一個小時之后，即可進行初級聽覺皮層神經元的雙光子鈣成像，并且成像記錄時間可以長達8個小時。在實驗的整個過程，小鼠的體溫保持在36.5–37.5°C。

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清醒動物的雙光子鈣成像

對于清醒動物的雙光子鈣成像實驗，首先會在小鼠異氟烷麻醉并注射局麻藥利多卡因的狀態下去除初級聽覺皮層上方的皮膚和肌肉。對于清醒動物，設計了不同于麻醉動物的顱骨固定裝置，將此塑料固定裝置粘附至小鼠初級聽覺皮層上方顱骨后，小鼠需恢復5天。之后，粘有固定裝置的小鼠將接收維持3-5天的頭部固定訓練，每天1-4小時不等，循序漸進。在整個訓練的過程當中，小鼠的頭部和整個身體會沿其身體長軸旋轉70°以便其初級聽覺皮層剛好與顯微鏡鏡頭保持垂直，利于觀察。在頭部訓練過后，小鼠逐漸變得適應于這個姿勢，并且能安靜的維持4個小時。在雙光子實驗當天，初級聽覺皮層腦表面才被暴露出來并做鈣染料標記實驗。與麻醉動物的成像實驗相同，清醒動物的皮層表面也覆蓋有不斷循環的人工腦脊液。實驗過程當中，清醒動物的狀態由一臺紅外攝像機（采樣頻率為30Hz）進行監測。當小鼠處于清醒狀態時，能經常觀察到其睜開的眼睛，經常抖動的胡須以及理毛行為等。

清醒與麻醉狀態下，初級聽覺皮層第2/3層神經元在連續規律聲音刺激過后呈現出回聲響應信號

采用ED1靜電聲音驅動器和自由場ES1揚聲器來提供聲音刺激。揚聲器置于距離小鼠對側耳約6厘米的位置。背景噪音主要由低頻聲音構成，與之前文獻中報導的類似。在本工作中所用的聲音刺激時長均為100ms。測試聲強時，同樣將揚聲器放置距離麥克風約6厘米的位置。聲音刺激的數據經由一臺高速數據采集板USB-6361以1 MHz的采樣率收集。白噪音（帶寬：0-50kHz）的聲強為76分貝，遠高于背景噪音。對于1 kHz到10 kHz的純音刺激，0分貝衰減對應于79分貝聲強，而對于10 kHz到40 kHz范圍的純音刺激，0分貝衰減則對應于81分貝聲強。

記錄到的神經元鈣信號能夠高保真的反映神經元的閾上電信號。此外，在一個鈣成像的焦平面，最多可以同步記錄100個神經元的活動（平均為51個），不同焦平面之間間隔100微米左右，一只小鼠記錄3個焦平面。在記錄神經元鈣活動的同時，小鼠會接受一串間隔相同時間的白噪聲刺激（單詞刺激時長：100ms；刺激之間的間隔為1s，2s，3s，4s，6s和10s中的一種），白噪聲刺激次數為10次，或者20次，或者30次，每一串的聲音刺激間隔固定。觀察到初級聽覺皮層神經元隨機的自發活動，以及對聲音刺激的響應。基于來自四個動物的486個神經元對前十次聲音刺激的反應，分析發現聽覺皮層神經元對白噪音的響應率從0%到100%都存在：39%的神經元的響應率超過50%；43%的神經元低于50%；剩下的18%是完全不響應的“沉默”神經元。總體來說，與自發活動相比（相同的時間窗；平均自發反應率：16%），大約85%的神經元在聲音刺激期間表現出更高的反應率。

在一次實驗當中，小鼠接受一連串間隔2s共20次白噪聲刺激。類似于被聲音刺激誘發（實際沒有聲音刺激），這三個神經元在聲音刺激結束之后仍繼續以相同的時間間隔在相應的時間點活動1-3次。將這些緊跟著聲音刺激之后出現的“額外應答”命名為“回聲響應”。聽覺皮層第2/3層神經元中約有15%的神經元表現了這些回聲響應。此外，聽覺皮層第2/3層神經元中大約3.8%的神經元產生了回聲相應而沒有對聲音的應答。大部分（72%）神經元在聲音刺激結束之后只出現一次回聲響應。所有這些成像觀察到的神經元（包括非回聲響應神經元）的平均回聲響應幅度要顯著高于回聲響應時間點之前的自發鈣活動的幅度。但將規律聲音刺激的時間間隔變更為4秒時，同樣有部分神經元表現出了回聲響應特性。同時，這些神經元表征出來的回聲響應相對于最后一次聲音刺激的潛伏期也與之前聲音刺激的時間間隔（4秒）保持了高度的一致。相反，如果將聲音刺激的時間間隔打亂（每間隔一個2秒后，就用一個3秒的間隔去打亂節奏），發現就沒有了顯著性回聲響應現象的出現。

雙光子成像下初級聽覺皮層第2/3層神經元的自發活動和聲音刺激引發的應答活動

參考文獻：

• 李景程. 初級聽覺皮層預測相關神經機制[D].第三軍醫大學,2017.

• Predictive information processing in the brain: The neural perspective[J]. Israel Nelken.International Journal of Psychophysiology,2011(2)

• Laminar Structure of Spontaneous and Sensory-Evoked Population Activity in Auditory Cortex[J]. Shuzo Sakata;;Kenneth D. Harris.Neuron,2009(3)