近日，Plant Biotechnology Journal雜志在線發(fā)表了西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院王西平教授課題組的研究論文“A module with multiple transcription factors positively regulates powdery mildew resistance in grapevine”。該研究證實(shí)，轉(zhuǎn)錄因子VqWRKY46通過(guò)誘導(dǎo)更強(qiáng)的過(guò)敏性細(xì)胞壞死（HR）、積累更多的過(guò)氧化氫（H?O?）和胼胝質(zhì)，并上調(diào)多種防御相關(guān)基因的表達(dá)，顯著增強(qiáng)了葡萄對(duì)白粉病的抗性。進(jìn)一步研究表明，VqWRKY46受到上游轉(zhuǎn)錄因子VqLIMYB的正調(diào)控，并能與轉(zhuǎn)錄因子VqNF-YC9互作，促進(jìn)后者基因的表達(dá)。同時(shí)，VqWRKY46還可直接靶向抗性（R）基因VqDSC1并激活其轉(zhuǎn)錄；盡管VqNF-YC9本身無(wú)法結(jié)合VqDSC1，但其與VqWRKY46的互作增強(qiáng)了對(duì)VqDSC1的轉(zhuǎn)錄激活作用。該研究揭示了中國(guó)野生毛葡萄VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9- VqDSC1信號(hào)模塊調(diào)控白粉病抗性的分子機(jī)制，為葡萄抗病分子育種提供了新的理論基礎(chǔ)。

葡萄白粉病（PM）是由葡萄鉤絲殼菌（Erysiphe necator Schw. (syn. Uncinula necator [Schw.] Burr.)）引起的一種真菌性病害(Gadoury et?al., 2012)，嚴(yán)重制約著葡萄和葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。研究表明，植物主要通過(guò)病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）和效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI）抵御病原菌入侵。在ETI過(guò)程中，核苷酸結(jié)合富亮氨酸重復(fù)受體（NLRs，即R基因編碼產(chǎn)物）能夠識(shí)別病原菌分泌的效應(yīng)蛋白，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終引發(fā)HR反應(yīng)（Jones & Dangl, 2006）。前期課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析并結(jié)合異源過(guò)表達(dá)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子VqWRKY46是葡萄白粉病的正調(diào)控因子（Zhao et al., 2018; Jiao et al., 2021）。此外，MYB、NF-YC等轉(zhuǎn)錄因子家族亦被證實(shí)參與植物病原菌抗性調(diào)控（Chezem et al., 2017; Qi et al., 2019）。然而，這些轉(zhuǎn)錄因子在葡萄中的具體功能及調(diào)控白粉病抗性的分子機(jī)制仍不明確。西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院王西平教授課題組在此基礎(chǔ)上，揭示了中國(guó)野生毛葡萄‘商-24’中VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信號(hào)模塊調(diào)控葡萄抗白粉病的分子機(jī)制，為葡萄抗病遺傳育種提供了關(guān)鍵理論依據(jù)。全文主要研究結(jié)果如下：

1. VqWRKY46是葡萄白粉病正調(diào)控因子

為明晰VqWRKY46在葡萄中的抗病功能，該研究借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)基因體系（Zhang et?al.,?2021），成功獲得VqWRKY46穩(wěn)定過(guò)表達(dá)株系（OE、OE）和干擾株系（RNAi、RNAi）（圖1a）。接種葡萄白粉菌9d后，與野生型（WT）相比，過(guò)表達(dá)植株表現(xiàn)出分生孢子數(shù)量減少、菌絲長(zhǎng)度縮短，同時(shí)伴隨胼胝質(zhì)積累增加、過(guò)氧化氫（H?O?）含量升高及HR反應(yīng)增強(qiáng)等現(xiàn)象（圖1b-f），以及防御相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖1g）；而干擾植株的表型則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)（圖1）。上述結(jié)果證實(shí)，VqWRKY46正向調(diào)控葡萄對(duì)白粉菌的抗性。

圖1 VqWRKY46增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因葡萄對(duì)白粉病抗性

2. VqLIMYB直接結(jié)合VqWRKY46啟動(dòng)子上Myb motif（CAGTTA）并促進(jìn)其表達(dá)

為探究VqWRKY46的上游調(diào)控機(jī)制，該研究通過(guò)酵母單雜交（Y1H）文庫(kù)篩選，鑒定到轉(zhuǎn)錄因子VqLIMYB。生物信息學(xué)分析顯示，VqWRKY46啟動(dòng)子區(qū)域存在MYB家族轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)合基序（Myb motif: CAGTTA）。Y1H試驗(yàn)證實(shí)，VqLIMYB可特異性結(jié)合該啟動(dòng)子區(qū)域（圖2a）。進(jìn)一步的凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）表明，VqLIMYB與Myb motif元件的直接互作具有序列特異性（圖2b）。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)（DLR）及GUS活性檢測(cè)結(jié)果顯示，VqLIMYB可顯著增強(qiáng)VqWRKY46啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性（圖2c-e）。上述結(jié)果表明，VqLIMYB通過(guò)直接結(jié)合VqWRKY46啟動(dòng)子上的Myb motif元件，激活其表達(dá)。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得VqLIMYB過(guò)表達(dá)和缺失轉(zhuǎn)基因植株（OE-VqLIMYB、RNAi-VqLIMYB），接種白粉菌后的表型分析顯示，VqLIMYB過(guò)表達(dá)顯著增強(qiáng)葡萄對(duì)白粉病的抗性（圖2f-h）。

圖2 VqLIMYB結(jié)合VqWRKY46啟動(dòng)子上Myb motif并激活其轉(zhuǎn)錄

3. VqWRKY46與VqNF-YC9相互作用并促進(jìn)VqNF-YC9的轉(zhuǎn)錄

為解析VqWRKY46的互作蛋白網(wǎng)絡(luò)，該研究利用酵母雙雜交（Y2H）文庫(kù)篩選獲得轉(zhuǎn)錄因子VqNF-YC9。通過(guò)Y2H驗(yàn)證、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）、分裂熒光素酶互補(bǔ)（Split-LUC）、Pull-down及熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET-AB）等試驗(yàn)，證實(shí)VqWRKY46與VqNF-YC9存在直接互作（圖3）。此外還發(fā)現(xiàn)，VqWRKY46與VqNF-YC9均可通過(guò)自身互作形成同源二聚體。

圖3 VqWRKY46與VqNF-YC9相互作用

進(jìn)一步研究表明，VqNF-YC9啟動(dòng)子區(qū)域含有3種典型的WRKY結(jié)合基序W-box（Wbox1: TTGACC；Wbox2: TTGACT；Wbox3: TTGACA）。通過(guò)Y1H、EMSA及DLR試驗(yàn)，證實(shí)VqWRKY46可直接結(jié)合上述W-box元件并激活VqNF-YC9的轉(zhuǎn)錄（圖4a-d）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析顯示，VqNF-YC9在VqWRKY46過(guò)表達(dá)株系（OE、OE）中的表達(dá)量顯著高于野生型（WT），而在干擾株系（RNAi、RNAi）中表達(dá)量則呈下調(diào)趨勢(shì)（圖4e）。上述結(jié)果表明，VqWRKY46與VqNF-YC9之間存在雙重調(diào)控關(guān)系：既能通過(guò)蛋白互作形成功能復(fù)合體，又能通過(guò)靶向啟動(dòng)子W-box元件調(diào)控VqNF-YC9的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而構(gòu)成多層次協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化獲得VqNF-YC9過(guò)表達(dá)和缺失轉(zhuǎn)基因植株（OE-VqNF-YC9、RNAi-VqNF-YC9），接種白粉菌后的表型分析表明，VqNF-YC9過(guò)表達(dá)可顯著增強(qiáng)葡萄對(duì)白粉病的抗性（圖4f, g）。

圖4 VqWRKY46與VqNF-YC9的啟動(dòng)子上W-box元件結(jié)合并激活其表達(dá)

4. VqNF-YC9增強(qiáng)VqWRKY46對(duì)VqDSC1啟動(dòng)子的激活作用

為深入鑒定VqWRKY46的直接靶基因，該研究采用DNA親和純化測(cè)序技術(shù)（DAP-seq）進(jìn)行分析，共鑒定到416個(gè)重疊結(jié)合峰，其中約28%定位于啟動(dòng)子區(qū)域。基序富集分析顯示，核心順式元件為典型W-box（TTGACC/T）（圖5a-c）。重點(diǎn)關(guān)注到抗病基因VqDSC1，其啟動(dòng)子區(qū)域含有3個(gè)Wbox1（TTGACC）和4個(gè)NF-YC類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)CCAAT。通過(guò)Y1H、EMSA及DLR試驗(yàn)，證實(shí)VqWRKY46可特異性結(jié)合Wbox1并激活VqDSC1轉(zhuǎn)錄；而VqNF-YC9雖無(wú)法直接結(jié)合CCAAT位點(diǎn)，但與VqWRKY46互作后可顯著增強(qiáng)其對(duì)VqDSC1啟動(dòng)子的激活作用（圖5d-g）。RT-qPCR結(jié)果顯示，VqDSC1在VqWRKY46過(guò)表達(dá)株系（OE、OE）中顯著上調(diào)，在干擾株系（RNAi、RNAi）中顯著下調(diào)，且其表達(dá)受白粉菌誘導(dǎo)顯著增強(qiáng)（圖5h-i）。功能驗(yàn)證表明，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)VqDSC1（OE-VqDSC1）可誘導(dǎo)超敏反應(yīng)（HR）并增強(qiáng)葡萄白粉病抗性，而干擾株系（RNAi-VqDSC1）則表現(xiàn)出感病表型（圖5j-k）。綜上，該研究揭示VqWRKY46與VqNF-YC9通過(guò)形成同源二聚體及蛋白復(fù)合體的雙重機(jī)制，協(xié)同調(diào)控VqDSC1的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)葡萄白粉病抗性。研究最終闡明了VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信號(hào)模塊的抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6），為葡萄抗病分子育種提供了關(guān)鍵基因靶點(diǎn)及理論支撐。

圖5 VqNF-YC9協(xié)同VqWRKY46激活抗性基因VqDSC1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

圖6 VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9-VqDSC1信號(hào)模塊調(diào)控葡萄抗白粉病的分子機(jī)制

西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院已畢業(yè)博士研究生張修銘（現(xiàn)任職于寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院）、張祺涵、朱彥勛為論文共同第一作者，王西平教授與美國(guó)馬里蘭大學(xué)Hua Lu教授為共同通訊作者。

該研究受國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（32272693、31872071）及陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2025JC-QYCX-023）資助。

論文鏈接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70196