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前言

自然殺傷（NK）細胞是起源于淋巴的細胞毒性先天免疫細胞。1973年，人們發現了一種非T非B淋巴細胞亞群可有效殺死被抗體識別的細胞，隨后首次被描述為“null”殺傷細胞。兩年后，有報道稱這種細胞能夠殺死各種類型的腫瘤細胞，并創造了術語“自然”殺傷細胞。NK細胞不僅在抗腫瘤反應中發揮作用，而且在抵抗微生物感染方面也發揮作用。

NK細胞表達多種激活和抑制受體，這些受體介導的信號之間的平衡決定了NK細胞激活的結果。NK細胞在沒有預先致敏的情況下殺死癌細胞的能力在腫瘤免疫監測中發揮重要作用。以 NK 細胞為基礎的腫瘤免疫治療領域已經到了一個激動人心的關頭。雖然這些療法還沒有取得與過繼性 T 細胞療法同樣程度的臨床成功，但是早期的令人鼓舞的結果使 NK 細胞療法的開發熱情越來越高。

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NK細胞生物學

NK細胞是第一個被鑒定的先天性淋巴細胞（ILC）亞型，能對病毒感染和/或轉化的細胞產生多種效應器功能，主要是細胞殺傷和產生促炎細胞因子。NK細胞和其他ILC家族成員（—1型ILC（ILC1s）、ILC2s和ILC3s）與B細胞和T細胞來源于相同的淋巴祖細胞。NK細胞的細胞毒性活性使它們在功能上與CD8+T細胞最為相似，而ILC1、ILC2和ILC3群體的細胞因子生成模式將這些細胞分別對應CD4+T細胞的TH1、TH2和TH17亞群。

NK細胞的兩個最典型的亞群是CD56brightCD16-和CD56dimCD16+群體。CD56bright細胞在外周血中的數量較少（循環中90%的NK細胞是CD56dim），而組織中的NK細胞主要是CD56bright。CD56bright NK細胞是強有力的細胞因子產生者，除非受到促炎性細胞因子如IL-15的刺激，否則細胞毒性較弱。相比之下，CD56dim NK細胞群可介導感染細胞和惡性細胞的連續殺傷，主要通過包含顆粒酶B和穿孔素的預先組裝的溶細胞顆粒在免疫突觸中的胞吐，最終誘導靶細胞凋亡。

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NK細胞的抗腫瘤效應機制

NK細胞具有多種功能，可以限制癌細胞的生長和擴散。在TME先天性和適應性免疫細胞產生促炎性趨化因子的指導下，循環NK細胞可被招募到腫瘤發生的部位。CXCR3–CXCR4、CX3CR1和CCR3–CCR5是NK細胞亞群差異表達的主要趨化受體。

進入TME后，NK細胞可以通過“丟失自我”機制殺死癌細胞。許多癌細胞下調MHC I分子的表達，以逃避細胞毒性CD8+T細胞的檢測，然而NK細胞能夠識別和響應這種缺失的自我表型的細胞，最終導致靶細胞裂解。因此，在T細胞不能識別MHC I下調癌細胞的情況下，NK細胞具有治療潛力。

ADCC是NK細胞介導的殺傷癌細胞的另一個關鍵機制。除了直接誘導細胞毒性外，NK細胞還通過產生促炎性細胞因子（包括IFN-γ和TNF）對轉化細胞作出反應。

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NK細胞的免疫檢查點抑制

關于ICI的研究主要集中在抗腫瘤T細胞的去抑制，這種治療模式增強NK細胞的活性也引起了相當大的關注。例如，人源化抗NKG2A單克隆抗體monalizumab目前正在對多種癌癥患者進行單藥試驗，或與其他免疫檢查點抑制劑聯合應用，臨床前數據表明這種藥物能顯著增強NK細胞和T細胞的細胞毒性。

TIGIT是另一種由NK細胞和T細胞表達的抑制性受體，其配體在人類腫瘤浸潤的NK細胞上過表達。在一些小鼠模型中，TIGIT抑制逆轉NK細胞衰竭并促進NK細胞依賴性抗腫瘤免疫。已經設計了一些積極的臨床試驗來測試單獨抗TIGIT藥物以及與其他免疫檢查點抑制劑聯合使用的有效性和/或安全性。（如NCT03119428、NCT04150965、NCT04047862、NCT04256421、NCT03563716和NCT04294810）

另外還有LAG-3和TIM-3，來自小鼠NK細胞研究的數據表明LAG-3在介導對腫瘤細胞系的細胞毒性方面起著積極作用；肺腺癌患者NK細胞上TIM-3表達增加預示著不良預后，體外抑制這種NK細胞的TIM-3增強了其細胞毒性和IFNγ的產生。目前，多個臨床試驗正在對各種癌癥患者進行LAG-3和TIM-3抑制劑的試驗，（包括NCT01968109、NCT04150965、NCT04140500、NCT03625323、NCT0331142、NCT03066648、NCT03489343、NCT03680508和NCT04139902等）。

其它基于NK細胞的免疫檢查點還包括CD96、 Siglec-7/9、CD200R、CD47、CTLA-4、PD-1和B7-H3，將這些檢查點結合起來進行協同抗腫瘤反應是未來充分發揮NK細胞殺傷腫瘤作用的方向。

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過繼性NK細胞療法

異基因外周血NK細胞只是治療性NK細胞眾多潛在來源之一。NK細胞約占外周血淋巴細胞總數的10%，而臍帶血（UCB）中的NK細胞占淋巴細胞總數的30%；因此，UCB是治療效應NK細胞的可靠來源。UCBNK細胞的治療效果目前正在一些臨床試驗中進行評估（如NCT01619761和NCT02280525）。

克隆性NK細胞系，如NK-92、KHYG-1和YT細胞，是異基因NK細胞的替代來源，NK-92細胞系已在臨床試驗中得到廣泛測試。然而，這些細胞是非整倍體，因此遺傳不穩定，這就要求它們在輸注前接受輻照。輻照的NK-92細胞被觀察到可以殺死癌癥患者的腫瘤細胞。

此外，臨床上正在對來自多種來源的干細胞衍生NK細胞產物進行檢測，包括來自UCB干細胞或誘導多能干細胞（IPSC）的NK細胞產物。將成年細胞重新編程為多能干細胞，以使其分化為NK細胞并擴展生成最終產物，是基于iPSC的方法的一個獨特特征。一項臨床試驗目前正在招募血液或實體癌患者，以測試這些現成的iPSC衍生NK細胞的安全性。

適應性NK細胞是治療性NK細胞的另一個新興來源。適應性NK細胞是一種自然發生的細胞群，在HCMV感染或再激活后在人類中擴增。HCMV UL40衍生肽抗原-HLA-E復合物與NK細胞上NKG2C之間的相互作用，導致NKG2ChiCD57+NK細胞增殖，NKG2ChiCD57+NK細胞下調參與細胞內信號傳導的某些蛋白質，包括PLZF、SYK和FcεRIγ。適應性NK細胞具有一些獨特的效應器特性，包括增強的ADCC、增強的細胞因子反應和對MDSCs和Treg細胞免疫抑制作用的固有抵抗。目前，三項臨床試驗正在評估這些適應性NK細胞對各種癌癥患者的療效。

細胞因子誘導記憶樣（CIML）NK細胞是異基因細胞治療的另一種選擇，與其他類型的NK細胞產品相比具有獨特的優勢。CIML-NK細胞在體外通過IL-12、IL-15和IL-18的短暫啟動，產生對細胞因子反應增強的NK細胞，并激活持續數周至數月的受體刺激。將這些CIML-NK細胞輸注到攜帶AML異種移植物的小鼠體內可產生強大的抗腫瘤作用并顯著延長存活時間。在I期試驗中，CIML NK細胞具有良好的安全性，在44%的可評估AML患者（4/9）體內擴增并誘導病情緩解。

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CAR-NK

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-NK細胞免疫療法比CAR-T細胞免疫療法更安全，而且NK細胞的安全性已在一些臨床領域得到驗證。例如，一些I/II期試驗顯示，同種異體NK細胞輸注耐受性良好，不會引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細胞是一種適應性更強的CAR載體，而不僅僅局限于自體細胞。

NK細胞上表達的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結構域、跨膜區以及胞內的信號結構域。胞外結構域由一個信號肽和識別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區將這個結構連接到跨膜區，它也在細胞內連接到包含激活信號的胞內結構域。成功的CAR設計是通過仔細的設計和功能測試相結合來實現的。

載體骨架和啟動子

載體骨架包含表達CAR所需的所有元件，如啟動子、polyA信號和轉錄調控片段。

啟動子的選擇直接影響到轉基因的表達水平。目前，對不同啟動子在NK細胞系中的CAR表達和功能的比較只有一次報道，而對原代NK細胞沒有比較數據。就這一次單個報告來看，還不能確定CAR-NK細胞的最佳啟動子。

目前關于CAR-NK細胞的報道顯示，多種啟動子被用于驅動CAR的表達，無論是細胞系來源的還是原代NK細胞。在原代CAR-NK和CAR-NK細胞系中，病毒啟動子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號肽

在信號肽中存在著巨大的異質性，這直接轉化為不同水平的蛋白質分泌效率。對于CAR-NK和CAR-T細胞，還沒有確定最佳信號肽的比較研究。目前，CD8a-SP是原代NK細胞最常用的信號肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK細胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽（29%）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結合域，該結構域將決定CAR-NK細胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對于CAR-NK設計，大多數更喜歡VH-VL方向，而不是VL-VH方向。

Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細胞上抗KDR CAR的表達水平。

此外，細胞可以配備多個單鏈抗體，從而擴大CAR效應細胞的抗原識別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉導，誘導兩個CAR結構的表達；或者將兩個單鏈抗體融合在一個結構中，產生串聯單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術已用于生產CAR-T細胞，但CAR-NK細胞仍未知。

目前大多數臨床CAR-T細胞試驗都使用了來自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細胞宿主抗移植物病的風險，這個問題可以通過人源化或篩選全人抗體避免。然而不幸的是，由于這些CAR受體的嵌合特性，即使是人源化的單鏈抗體也可能誘導宿主抗獨特型免疫反應。幸運的是，在迄今為止數量有限的CAR-NK臨床試驗中，沒有發現與抗CAR免疫反應相關的重大副作用。

連接區

重鏈和輕鏈之間的連接區有助于穩定單鏈抗體的構象，過短會導致多聚體的形成，過長可能導致水解或降低VH和VL結構域之間的關聯。對于CAR-NK細胞，五肽GGGGS的多聚體應用最為廣泛，通常為3個重復。另一個旨在增強蛋白水解穩定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數CAR-NK研究沒有提供連接細節，但已有的研究報道中，有22項使用了G4S連接，有2項應用了218連接。

鉸鏈區

鉸鏈區是連接單鏈抗體單位和跨膜結構域的CAR細胞外結構區，它通常維持效應細胞中穩健的CAR表達和活性所需的穩定性。大多數CAR-NK構建使用CD8α或CD28胞外結構域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區。

鉸鏈區的類型和長度對CAR的功能活動有重要影響。但是目前大多數信息全來自CAR-T領域，能否直接轉化為CAR-NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區之間的直接比較中，發現CD28更有可能促進CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區的CAR產生的激活刺激更強。雖然這可能是有益的，但也可能導致更嚴重的副作用。

IgG為基礎的鉸鏈區也廣泛應用于CAR結構。基于IgG鉸鏈區的一個主要優點是結構的靈活性，該結構通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3結構域組成。鉸鏈區的長度可以調節以適應抗原識別，但研究發現，間隔區越短，細胞因子的產生越高，CAR-T細胞增殖越快，體內持久性和抗腫瘤效果越好。

對于CAR-NK細胞，大多數研究在原代NK細胞（16/35）和CAR-NK細胞系（41/72）中均采用CD8α鉸鏈區。其它使用的鉸鏈區包括CD28、IgG Fc結構域和DAP12。

跨膜結構域

跨膜（TM）結構域連接CAR的胞外結構域和細胞內激活信號結構域，CAR-NK最常用的TM部分來自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。

TM結構域的選擇影響了CAR結構在細胞功能上的活化程度。通常在NK細胞上表達的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM會導致更多的CD107a脫顆粒和更高的細胞毒性，因此，TM的具體來源將決定CAR-NK的活性。

TM結構域的一個重要方面是，最佳TM區域應遵循T細胞或NK細胞上跨膜蛋白的蛋白質自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強大的NK細胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR-NK細胞中最常見，而CD28是CAR-NK細胞系的首選TM區域。

CAR-NK激活信號

CAR的細胞內激活信號的數量決定了其屬于哪一“代”CAR。

第一代CAR-NK細胞與CAR-T細胞一樣，只含有CD3ζ信號。第二代和第三代CAR-NK分別攜帶一個和兩個額外的共刺激信號，共刺激分子通常來源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相關受體家族（2B4）。到目前為止，唯一公布的CAR-NK臨床試驗采用了第二代CAR-NK構建，該構建通過加入IL-15表達和誘導Caspase9增強活性。

目前大多數CAR結構依賴于CD3ζ鏈信號域，強烈的激活信號對于誘導有效的抗腫瘤反應很重要，但也可能導致效應細胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準所需的免疫細胞反應。與基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現出更快的效應器特征，誘導更高水平的IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α。然而，這種強烈的共刺激信號也會導致活化誘導的細胞死亡（AICD）。

相比較，4-1BB-CD3ζ信號優先誘導記憶相關基因和持續的抗腫瘤活性。原因可能是4-1BB結構域改善了CD28結構域引起的T細胞耗竭。

如上圖所示，在CAR-NK細胞系和原代CAR-NK細胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個額外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代結構，CD28/4-1BB/CD3ζ的組合是最常用的。

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NK細胞定向接合器

各種免疫逃避機制限制了NK細胞在體內與腫瘤細胞的結合程度，是實現廣泛有效的NK細胞治療的主要障礙。為了增強腫瘤浸潤性NK細胞的自然細胞毒性，許多研究團隊已經在開發一些分子，使這些細胞以抗原特異性的方式與腫瘤細胞接觸。這些分子通常是由多個抗體（通常為單鏈抗體）組成的雙特異或三特異性接合器，使得一個結構域針對NK細胞激活受體，另一個與特定腫瘤相關抗原結合。例如，一種由兩個單鏈抗體組成的三特異性殺傷接合器（TriKE），一個針對NK細胞上的CD16，另一個針對AML細胞的CD33，通過IL-15結構域連接，該結構域旨在增強NK細胞的存活和增殖。

這種抗CD16、IL-15和抗CD33 TriKE（GTB-3550）增強了NK細胞效應器功能的其他幾個重要方面，在臨床前研究中觀察到了改善遷移能力、增加連續殺傷和縮短首次殺傷時間。

在臨床前研究中，其他幾種NKCE分子也被證明具有強大的抗腫瘤作用。AFM13靶向淋巴瘤相關抗原CD30和CD16a，后者是NK細胞表達的CD16的跨膜形式。AFM13在AACR 2022中表現驚艷，AFM13+臍血來源NK細胞治療，完全緩解率達到62%。

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展望

自然殺傷細胞是一組獨特的抗腫瘤效應細胞，具有不受MHC限制的細胞毒性、產生細胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統中的關鍵角色。一些癌癥的發生與功能失調的NK細胞有關。因此，修復這種NK細胞可能是抗腫瘤免疫治療的一個潛在選擇。這種修復的一種方法是抑制免疫檢查點，即癌細胞通過控制免疫細胞表面的抑制受體進行免疫逃逸。

利用NK細胞與抗體、免疫細胞接合器、CARs和其它檢查點抑制劑的組合方法進行試驗，這些方法旨在調節抑制檢查點和增強抗腫瘤能力。目標是找到一種基于NK細胞的治療策略，這種策略是安全的，并且具有廣泛臨床應用所需的確切療效。

參考文獻：

1.Exploring the NK cell platform for cancer immunotherapy. Nat RevClin Oncol. 2020 Sep 15.

2. K Cell-Based Immune Checkpoint Inhibition. Front. Immunol., 13February 2020

3. CAR-expressing NK cells for cancer therapy: a new hope. BiosciTrends. 2020 Sep 6.

4. Chimeric antigen receptornatural killer (CAR-NK) cell design and engineering for cancer therapy. JHematol Oncol. 2021; 14: 73.

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