藥物敏感性試驗(yàn)（AST）簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（或耐藥試驗(yàn)），旨在了解病原對(duì)各種藥物的敏感（或耐受）程度，以指導(dǎo)藥物治療中合理選用藥物的微生物學(xué)試驗(yàn)。某種藥物如果能以很小的劑量抑制、殺滅病原，則稱該種病原對(duì)該藥物“敏感”。反之，則稱為“不敏感”或“耐藥”。為了解致病原對(duì)哪種藥物敏感，以合理用藥，減少盲目性，就應(yīng)該進(jìn)行對(duì)致病生物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 培養(yǎng)基

一般情況下采用MH瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行，具體配制方法參照說明書進(jìn)行。做不同細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)可選擇不同的培養(yǎng)基，比如做鏈球菌的藥敏試驗(yàn)可選擇腦-心浸萃液瓊脂培養(yǎng)基。

制備MH瓊脂平板具體要求： 應(yīng)用直徑90mm平皿，在水平的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上傾注。瓊脂厚4±0.5 mm(25～30 mL培養(yǎng)基)，凝固后用密封袋包裝放4℃保存，在5天內(nèi)用完，使用前應(yīng)在37℃培養(yǎng)箱烤干平皿表面水滴，但要保持瓊脂表面潮濕。

2. 實(shí)驗(yàn)菌株

待做藥敏試驗(yàn)的細(xì)菌，必須是已純化新鮮菌株 (圖1)。

圖1 已純化新鮮菌株

3. 藥敏紙片

(1) 購(gòu)買商品化藥敏紙片 (圖2)。

圖2 藥敏紙片

(2) 自制藥敏紙片。

采用新華1號(hào)定形濾紙，用打孔機(jī)打成6mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的小瓶或者平皿中，以單層牛皮紙包扎。經(jīng)121℃ 20min高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使其完全干燥 (圖3、圖4)。

圖3 打孔機(jī)制備小紙片

圖4 單層牛皮紙包扎

抗菌藥的稀釋劑通常用無菌蒸餾水，一般按照商品藥物使用說明書上配料，按1g需加多少毫升水，就相當(dāng)于配制藥液所加蒸餾水的毫升數(shù)。比如10g藥物可配50kg藥液，其換算方法是：1g本品加5000mL蒸餾水，此溶液即為用于藥敏試驗(yàn)的藥液。

按每張紙片飽和吸水量為0.001mL計(jì)算，在上述含有50片紙片的小瓶或平皿內(nèi)加入藥液0.5mL，不時(shí)翻動(dòng)，使濾紙片將藥液均勻吸凈，一般浸泡30min即可 (圖5)。

圖5 紙片浸泡藥液

同時(shí)記錄藥物名稱，于37℃干燥箱過夜。在干燥箱中的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，以免某些藥物失效。

圖6 室溫放置后取出藥敏紙片

(3) 藥敏紙片的保存。

藥敏紙片應(yīng)保存在干燥環(huán)境，可在-20℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存，日常使用的小量紙片可在4℃保存，時(shí)間不超過1周。使用時(shí)從低溫取出后，放置到室溫后才可打開，剩余未用完的應(yīng)立即放回冰箱內(nèi)的密閉容器內(nèi) (圖6)。過期紙片不能使用，應(yīng)棄去。

二、實(shí)驗(yàn)操作方法

1.將待檢菌接種于MH瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16～18h或根據(jù)菌株生長(zhǎng)的需要進(jìn)行培養(yǎng)，然后無菌操作挑取瓊脂平板上的純培養(yǎng)菌落，置于3mL無菌生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁，調(diào)整濁度與比濁管 (0.5麥?zhǔn)蠁挝?相同 (圖7、圖8)。

圖7 挑取純培養(yǎng)菌落

圖8 調(diào)整菌液濁度

2.在無菌操作臺(tái)中，用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多余菌液。用棉拭子涂布整個(gè)培養(yǎng)基表面，反復(fù)幾次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿周邊繞2圈，確保涂布均勻 (圖9至圖12)。

圖9 無菌棉拭子蘸取菌液

圖10 管壁上擠壓去掉多余菌液

圖11 涂布培養(yǎng)基表面

圖12 沿周邊涂布

3.待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。每個(gè)平板貼6張紙片，每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm，在菌接種后15min內(nèi)貼完紙片 (圖13)。

圖13 藥敏紙片貼在平板表面

4.將平板在室溫放置20～30min，以利于藥敏紙片上的藥物充分?jǐn)U散。

5.將平板反轉(zhuǎn)，28℃恒溫培養(yǎng)16～18h，觀察結(jié)果。

三、結(jié)果觀察

1.測(cè)量抑菌圈：手持平板從背面目測(cè)檢查，借助游標(biāo)卡尺、普通尺等測(cè)量抑菌環(huán)直徑，抑菌環(huán)直徑需包含紙片直徑，單位為毫米，測(cè)量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄 (圖14)。

圖14 測(cè)量抑菌圈直徑

2.抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長(zhǎng)，進(jìn)入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長(zhǎng)，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。

3.在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個(gè)抑菌環(huán)，抑菌環(huán)越大，說明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌環(huán)，則說明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、涂布細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。

4.結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所選藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)。

來源：水產(chǎn)百科，內(nèi)容有修編

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