顧名思義，在反相色譜法 (RPC) 中，相的性質(zhì)與正相色譜（NPC）中使用的相不同。在RPC中，固定相的極性低于流動相。這種反轉(zhuǎn)是通過將硅膠表面硅醇基的極性改變?yōu)榉菢O性基團來實現(xiàn)的。硅膠填料仍然是 RPC 中最常用的載體。極性硅醇基經(jīng)過化學修飾后，就變成了非極性的疏水性烴基載體，如十八烷基二氧化硅 (ODS)。圖 1 顯示了用于制備聚合物或單體固定相的氯硅烷反應(yīng)。通過改變有機硅烷上的側(cè)鏈 (R)，可以生產(chǎn)出多種商業(yè)化的鍵合固定相。表 1 列出了通過對硅膠的硅醇基進行化學修飾而制備的一些固定相。

表 1. 化學改性硅膠中的官能團。

在 RPC 中，流動相一般由水或緩沖水溶液與各種水溶性溶劑（如醇類）的混合物組成。從理論上講，當流動相和固定相之間的極性差異最大時，分離選擇性最高。在實際操作中，流動相的溶劑強度與固定相的疏水性相適應(yīng)，特定溶質(zhì)的洗脫 K' 值在 2 到 10 之間。

聚合物和單體鍵合相及末端封端

圖 5 所示的反應(yīng)方案說明了硅醇基與衍生試劑之間一一對應(yīng)的關(guān)系，即每一個硅醇基含有一個 R 基團。這種類型的相稱為單體相。通過使用三氯烷基硅烷而不是單氯烷基硅烷作為試劑，一對一反應(yīng)產(chǎn)生的產(chǎn)物可進一步與附近的硅醇基或另一個氯烷基硅烷發(fā)生反應(yīng)，從而形成多個層。這種類型的固定相被稱為聚合固定相。由于存在立體阻礙，硅膠上的硅醇基不會全部與衍生試劑發(fā)生反應(yīng)，因此會留下未反應(yīng)的殘留硅醇基。

任何殘留的硅醇基都會給固定相帶來極性，從而導致極性化合物（尤其是堿）出現(xiàn)拖尾。為了解決這個問題，鍵合相材料要與小的三甲基硅烷進一步反應(yīng)，因為三甲基硅烷的尺寸較小，可以更好地接觸到未反應(yīng)的硅醇基。這種方法被稱為 "封端法"。許多制造商都聲稱自己的包裝材料是 100% 封端或完全封端的。實際上，仍會有一些未反應(yīng)的硅醇基殘留。

與使用 ODS 色譜柱分析化合物相關(guān)的許多問題都可追溯到殘留硅醇基的存在。使用酸性流動相可以減少硅醇基的影響。硅醇基的 pKa值約為 3.5，因此在酸性條件下，硅醇基會被質(zhì)子化，從而降低電離效果。另一種流動相改良方法是在分析堿性化合物時加入 30 至 50 mM 的三乙胺，分析酸性化合物時加入乙酸銨，分析未知化合物時加入乙酸三甲胺。添加 10 mM 的二甲基辛胺或二甲基辛胺乙酸鹽可減少 ODS 色譜柱對堿性化合物的色譜特性差異。

碳載量和保留

在 RPC 中，固定相、流動相和樣品分子之間的疏水相互作用對保留起著主導作用。烷基鍵合相的保留受碳載量的影響很大，通常以百分比表示。固定相的含碳量取決于相對表面覆蓋率和鍵合官能團的鏈長。此外，還取決于硅膠支架的表面積和制造方法--單體、聚合和末端封端。對于 ODS 鍵合相，碳載量可在 10% 到 20% 之間變化，對于辛基硅烷鍵合相，該值通常為 5% 到 10%。隨著烷基（R）鏈長度的增加，溶質(zhì)保留時間也會增加。碳載量越高，固定相的疏水性就越強。

使用聚合物載體的 RPC

在藥物的 RPC 中，硅膠固定相仍然是最常用的固定相。不過，基于聚合物（苯乙烯-二乙烯基苯共聚物）的吸附劑正逐漸受到重視。硅膠吸附劑的主要缺點在于硅膠的 pH 值穩(wěn)定性。在堿性 pH 條件下，硅膠會緩慢溶解，這會大大縮短 HPLC 色譜柱的使用壽命。基于硅膠的 HPLC 色譜柱流動相 pH 值的有效范圍是 2 到 7，而基于聚合物的 RP 高效液相色譜柱在很寬的 pH 值范圍內(nèi)都很穩(wěn)定，通常為 pH 值 1 到 13。

與硅膠 RP-HPLC 色譜柱相比，聚合物 RPC 色譜柱可以選擇更多的流動相，尤其是在分離堿性化合物時。通過在高 pH 值下操作，堿離子化成為可能。聚合載體的主要缺點是聚合效率較低，對高壓的機械阻力較小。用于制造聚合物相的交聯(lián)工藝（圖 1）可產(chǎn)生具有良好孔徑控制的剛性球形顆粒。因此，它們也非常適合用于體積排阻色譜法。

RPC 的溶劑強度和洗脫能力

對于 RPC 而言，水是最弱的溶劑。在 RPC 中的保留受流動相中水濃度的控制，隨著水濃度的增加而降低。其中，在 RPC 中的保留類似于分配過程，而不是 NPC 的吸附過程。表 2 列出了 RPC 中常用溶劑的洗脫能力

反相離子對色譜

對于低質(zhì)量離子化合物，離子交換色譜法是唯一可行的選擇，但現(xiàn)在相當極性的化合物可以通過反相離子對色譜法分離出來。反相色譜和反相離子對色譜使用的色譜柱是相同的。不過，從實用的角度來看，最好還是為離子對色譜單獨配備一個色譜柱。離子對色譜法分離離子化合物有兩種方法。

第一種方法是調(diào)節(jié)流動相的 pH 值，使待測物呈中性或未離子化形式。這被稱為離子抑制。一般來說，中性形式的可電離化合物的保留率要高于電離形式。流動相和固定相的性質(zhì)對離子化合物保留的影響與中性化合物基本相同。

使用硅膠色譜柱時，離子抑制方法使用的流動相 pH 值范圍僅限于 2 至 7。

影響離子化合物在 RPC 上保留的第二種方法是離子對萃取技術(shù)。在這種技術(shù)中，通常會調(diào)節(jié)流動相的 pH 值，使相關(guān)化合物處于離子化狀態(tài)。然后通過在流動相中加入帶相反電荷的離子對試劑來控制保留。如下圖所示，離子對試劑形成的庫侖復合物表現(xiàn)為電中性和非極性化合物。

樣品 + 離子對離子 ------[樣品 - 離子對離子]

離子對試劑對中性物質(zhì)的影響微乎其微，但對樣品混合物中所有帶電物質(zhì)都有影響。該方法可用于分離同一樣品中的離子和非離子化合物。RPC 中常用的酸和堿的離子對離子有：

酸性化合物：季胺，如四甲基氫氧化銨 (TMAH)、四丁基氫氧化銨 (TBAH)、叔胺，如三丁胺。

堿性化合物：高氯酸、烷基和芳基磺酸鹽，如甲烷、戊烷、庚烷和樟腦磺酸。

使用硅膠反相柱時，所有離子對離子的流動相 pH 值應(yīng)保持在 2-7 之間。離子對試劑的濃度通常保持在 50-200 mM 范圍內(nèi)。化合物在反相離子對色譜中的保留受離子對試劑的濃度及其大小的影響。例如，在保持其他條件不變的情況下，將甲烷換成庚烷磺酸作為離子對離子，會導致待測物的保留時間延后。還應(yīng)通過改變流動相中有機溶劑的量來調(diào)整保留時間。